红景天苷调控APC-Cdh1对永生化神经前体细胞增殖分化的影响*

李立, 姚文龙, 张传汉

1湖北中医药大学基础医学院生理学教研室(湖北武汉 430065)；2华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室(湖北武汉 430030)

红景天苷是从红景天中提取的主要活性成分。大量的药理学研究表明，红景天苷具有提高机体免疫力，抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、降血糖等多种药理作用[1]。红景天苷可以有效穿过血脑屏障对中枢神经系统起保护作用[2-3]。张明发等[4]研究证明红景天苷对小鼠的生长发育有促进作用。另有多项研究结果显示红景天苷可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元细胞[5-6]。但是，关于红景天苷是否可以诱导神经干细胞分化为神经细胞的研究较少。后期促进复合物(anaphase promoting complex，APC)是一个多功能的泛素蛋白连接酶，通过泛素化降解不同的底物在包括细胞周期等各种细胞进程中发挥重要的作用[7]。APC的活性主要受两个调控因子Cdc20和Cdh1调节，Cdc20在有丝分裂的早期与APC结合，促进有丝分裂的进程；而Cdh1在有丝分裂的后期替代Cdc20与APC结合，调节有丝分裂的退出和G1/S期转换[8]。研究发现APC-Cdh1在海马、大脑皮层等终末分化的神经元中大量表达，对于有丝分裂后神经元的存活至关重要[9]，并且具有调节神经元轴突生长[10]，促进神经元分化[11]等多方面作用。因此，本研究从2017年1月至2019年1月通过观察红景天苷对体外永生化神经前体细胞(INPC)增殖分化及Cdh1表达的影响，探讨红景天苷体外诱导神经前体分化的可能作用机制，为临床应用红景天苷提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 细胞Neurobasal培养基、无血清培养添加剂b27购自Gibco公司；表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自PeproTech公司；红景天苷购自默克公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amerisco公司；RT-PCR试剂盒购自Takara公司；小鼠抗大鼠细胞微管相关蛋白2(MAP2)抗体购自Neomarkers公司。

1.2 细胞培养与处理 永生化神经前体细胞(INPC)用含20 mL/L b27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF的Neurobasal培养基在37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养。取对数生长期的INPC用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，分为红景天苷组与对照组。第2天细胞换液，红景天苷组加入100 μg/mL的红景天苷；对照组无任何药物处理。

1.3 MTT法测定细胞增殖能力 将INPC接种于96孔培养板中，5×104个细胞/孔，每组设8孔。细胞加入红景天苷作用48 h后，每孔加入2 g/L MTT 50 μL，培养4 h。然后吸去上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡10 min。在酶标仪上测定吸光度，以570 nm吸光度值反映细胞活力。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期 细胞加入红景天苷作用48 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，随后制成单细胞悬液，PBS 洗涤2次，加入75%预冷的乙醇固定16 h，再用PBS 洗涤2次，并将细胞悬液浓度调整为1×106个/mL，加入50 μg/mL的碘化丙啶和50 μg/mL的RNA酶，避光室温孵育1 h，最终用美国BD公司流式细胞仪测定细胞周期，采用FlowJo软件分析结果。

1.5 免疫细胞化学方法检测MAP2的表达 细胞加入红景天苷作用48 h后，先用PBS冲洗，再经甲醇固定15 min，后用2 mL/L Triton-PBS透膜15 min，然后牛血清白蛋白封闭30 min，采用1∶200的MAP2抗体检测MAP2的表达。

1.6 RT-PCR检测Cdh1与Id2mRNA的表达 细胞加入红景天苷作用48 h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA并测定RNA浓度，取500 ng RNA进行逆转录，以逆转录产物为模板进行PCR反应。RT-PCR引物见表1。PCR反应条件为：预变性94℃，10 s；变性94℃，5 s；退火及延伸60℃，20 s；反应40个循环。融解曲线按照2-△△Ct法分析目的基因Cdh1与Id2的相对表达量，△Ct=Ct(Cdh1或Id2)-Ct(β-actin)；△△Ct=干预组△Ct-对照组△Ct。

表1 RT-PCR引物汇总

2 结果

2.1 细胞增殖能力 与对照组(0.46±0.04)相比，MTT法检测红景天苷组(0.29±0.05)吸光度值降低(P<0.05)。

2.2 细胞周期 与对照组相比，红景天苷组G1～G0期细胞所占比例增加，由47.9%增加到56.8%(P<0.05)，而S期细胞减少，由35.8%减少到24.5%(P<0.05)，G2～M期细胞所占百分比两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

图1 流式细胞仪检测细胞周期分布

表2 两组细胞周期分布的比较

2.3 INPC向神经元分化的比较 给予干预48 h后，对照组细胞以椭圆形或三角形为主，细胞突起较短；红景天苷组细胞主要呈现2种形态，一种呈圆形或椭圆形的神经元样细胞，具有一个或两个长突起；另一种表现为星形胶质细胞样细胞，具有多个粗长突起。对照组分化为神经元的比例为(32.1±8.7)%，红景天苷组分化为神经元的比例为(64.3±6.2)%，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 免疫荧光检测两组细胞MAP2的表达(×200)

2.4 RT-PCR检测Cdh1、Id2 mRNA的表达 PCR结果显示，两组细胞中β-actin的表达无明显差异，但红景天苷组Cdh1表达较对照组升高，而Id2表达较对照组降低。Cdh1和Id2相对表达量两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 Cdh1和Id2 mRNA的表达

3 讨论

本研究中采用的INPC由高峰等[12]通过将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒转染原代培养的新生鼠神经前体细胞构建。该细胞株保留了原代神经前体细胞的细胞表型，具有自我更新和多向分化的潜能。科学研究证明神经前体细胞在神经系统的生长发育和修复替代受损的神经细胞中发挥重要的作用[13]。因此，如何诱导神经前体细胞分化成神经细胞值得探讨。

本研究结果显示INPC经过100 μg/mL红景天苷处理48 h后，通过流式细胞仪检测发现G1～G0期细胞增多，S期减少，说明红景天苷使INPC细胞周期停滞于G1/S转折点。虽然G2～M期细胞总数没有明显改变，但不能说明没有G2/M阻滞。另外，通过MTT法检测表明红景天苷使INPC增殖能力受到抑制。说明红景天苷对神经前体细胞增殖有抑制作用。

INPC具有多向分化的潜能。其可以被诱导分化为神经元样细胞或星形胶质细胞样细胞。MAP2是成熟神经元特异性的标记物，本研究通过MAP2免疫荧光结果发现，与对照组相比，经过红景天苷处理后MAP2阳性染色的神经细胞比例明显增加。该结果提示红景天苷促进INPC向神经元分化。因此，我们得出结论红景天苷可以抑制INPC增殖，促进其分化。

已有文献报道红景天苷可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元[5-6]，这与本研究结果一致。多项研究发现红景天苷是通过调控cyclin A、cyclin B、cyclin D1及p21等细胞周期相关蛋白的表达，从而抑制细胞的增值，改变细胞周期[14-15]。因此，我们从细胞周期相关蛋白的角度进一步探讨红景天苷促进INPC分化的机制。

Cdh1是细胞内泛素蛋白酶小体系统中一个重要的调节蛋白，在有丝分裂晚期及G1期，它与后期促进复合物APC结合，激活APC，泛素化降解周期蛋白和其他蛋白质，调控细胞周期的进程[16]。分化抑制因子2(inhibition of differentiation 2，Id2)是一种抑制细胞分化，促进细胞增值的转录调控因子。在发育的神经系统中，Id2促进细胞增值。但是APC-Cdh1复合物可以结合并降解Id2，从而使细胞退出细胞周期[17]。本研究发现红景天苷在抑制INPC增殖、促进其分化的同时，Cdh1表达明显增加，Id2表达明显减少，这提示Cdh1和Id2与INPC增殖分化有关。其可能的机制为：红景天苷通过上调Cdh1的表达，从而提高了APC-Cdh1的活性，APC-Cdh1继而结合并降解Id2，从而使得INPC从细胞周期退出，分化成神经元。

综上所述，红景天苷100 μg/mL能抑制INPC的增殖，促进其分化，后期促进复合物APC的调控因子Cdh1及其底物分化抑制因子Id2的表达变化是其作用机制之一。

利益相关声明：文章所有作者声明文章无利益冲突。

作者贡献说明：李立负责实验设计、实施和论文撰写；姚文龙负责结果分析；张传汉负责实验指导和论文修改。