氨基柱高效液相色谱法检测大豆提取物中的磷脂酰胆碱

王 瑞， 段旭林， 张琦弦， 吕远平， 何 强， 迟原龙

(四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065)

0 引 言

磷脂作为一种复合脂，是指含有磷酸的脂类。其作为一种从动植物组织中提取得到的混合物，主要由磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines, PC）、磷脂酰肌 醇 （phosphatidyl inositol, PI） 、 磷 脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidyl ethanolamine, PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）、鞘磷脂（sphingomyelin,SM）[1]等成分构成。其中，磷脂酰胆碱具有提高记忆力[2]、降低血清胆固醇[3]、抗氧化[4]等多种功效，在食品、畜牧业、医药、化妆品等领域[5-8]有着较为广泛的应用。

目前，磷脂酰胆碱的检测方法有高效液相色谱法[9]、钼蓝比色法[10]、薄层色谱法[11]、核磁共振法[12]等。钼蓝比色法检测的是总磷脂含量，薄层色谱法进行的是半定量分析且干扰因素较多，核磁共振法会对磷脂分子造成破坏，检测成本高，存在一定的局限性。与这些方法相比，高效液相色谱法同时兼具操作简单、不会破坏磷脂分子等优点，近年来在检测磷脂酰胆碱方面应用得较为广泛。而磷脂酰胆碱作为一种极性脂，十八烷基键合硅胶色谱柱（C18）等反相色谱柱对其保留、分离能力较弱。在目前相关研究中，所用的分离色谱柱主要集中在硅胶柱，硅胶柱的极性很强，是一种正相色谱柱，流动相多采用正己烷-异丙醇-水/酸等三元体系，较为繁琐[13-15]。氨基柱是一种以硅胶为基质，表面键合了氨丙基的色谱柱。与硅胶柱相比，氨基柱的极性更弱，可同时适用于正相和反相溶剂，且可基于极性吸附和弱阴离子交换两种作用对分离物质达到保留作用。本实验采用氨基色谱柱在反相条件下对大豆提取物中的磷脂酰胆碱进行检测，以极性较强的乙腈-水二元体系作为流动相，旨在提供一种简单、快速的磷脂酰胆碱检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆（市购）；乙腈（色谱级，美国Sigma公司）；丙酮（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；乙醇（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）；磷脂酰胆碱标准品（P7443，纯度≥99%，美国Sigma公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；SHISEIDO CAPCELL PAK UG80 氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；FA2204C电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；TGL-16型冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈∶水=80∶20（V/V）；检测波长：206 nm；流量：0.8 mL/min；进样量：50 µL；柱温：30 ℃；以峰面积为指标进行定量分析。

1.3.2 标准溶液的制备

准确称取磷脂酰胆碱标准品9.68 mg，用无水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀，制得质量浓度为96.80 mg/L的标准母液。准确吸取磷脂酰胆碱标准母液 4，8，12，16，20 mL，用无水乙醇进行梯度稀释，得到质量浓度分别为7.744，15.488，23.232，30.976，38.720 mg/L 的磷脂酰胆碱标准工作液。置冰箱中–20 ℃储藏备用。

1.3.3 大豆提取物的制备

将大豆洗净干燥后，粉碎，100目过筛，得到大豆粉。准确称取大豆粉60.08 g，加入3倍体积丙酮脱脂，得到脱脂大豆粉。按料液比为8∶1（mL/g）加入无水乙醇超声提取1 h，离心分离上清液。将上清液于40 ℃进行旋转蒸发浓缩，并用4 ℃的丙酮沉降。将得到的沉淀物真空干燥后，即得到粉末状的大豆提取物。

1.3.4 提取物待测溶液的制备

准确称取大豆提取物10 mg，用无水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，经0.45 µm的微孔滤膜过滤，置冰箱中–20 ℃储藏备用。

1.3.5 大豆提取物中磷脂酰胆碱含量的计算

按照下式计算大豆提取物中磷脂酰胆碱的含量：

式中：C−大豆提取物中磷脂酰胆碱的质量分数，%；

ρ——经过标准工作曲线计算得的提取物样品溶液中磷脂酰胆碱的浓度，mg/mL；

V ——提取物样品溶液的体积，mL；

M——提取物的质量，mg。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相比例的确定

探究了流动相比例对磷脂酰胆碱保留时间的影响。如图1所示，当流量为1.0 mL/min时，以乙腈∶水=85∶15（V/V）为流动相，磷脂酰胆碱的保留时间为 4.852 min；乙腈∶水=80∶20（V/V）为流动相，磷脂酰胆碱的保留时间为 4.410 min；乙腈∶水=75∶25（V/V）为流动相时，磷脂酰胆碱的保留时间为4.068 min。结果表明，降低乙腈的比例会使磷脂酰胆碱保留时间提前，但过低的乙腈比例会导致磷脂酰胆碱与其他物质分离不开，同时考虑到氨基柱的水相比例不宜太高，最终确定流动相比例为乙腈∶水=80∶20（V/V）。

图1 不同流动相比例下磷脂酰胆碱的色谱图

2.1.2 流速的选择

考察了流速对磷脂酰胆碱保留时间的影响。如图2所示，在流量为1 mL/min条件下，磷脂酰胆碱的保留时间为 4.410 min；流量为 0.8 mL/min 条件下，磷脂酰胆碱的保留时间为5.292 min。流速越大，磷脂酰胆碱出峰时间越早，考虑到分离效果与溶剂消耗，最终确定流量为0.8 mL/min。目前文献报道的磷脂酰胆碱保留时间集中在9～40 min 之间[14, 16-17]，本实验条件下磷脂酰胆碱的保留时间更短，检测更加快速。

图2 不同流速下磷脂酰胆碱的色谱图

2.2 标准曲线的绘制与检出限的确定

依次取上述不同浓度的磷脂酰胆碱系列标准工作液进样进行检测。以磷脂酰胆碱的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示。结果表明，磷脂酰胆碱的浓度与峰面积在7.744～38.720 mg/L范围内呈现较好的线性关系，线性回归方程为y=49.587x+196.34，相关系数r2=0.9996。以3倍信噪比（S/N）作为检出限确定标准，最终确定检出限为1.54 mg/L。

图3 磷脂酰胆碱标准曲线

2.3 精密度实验

取同一磷脂酰胆碱标准样品，按1.3.1中的条件连续进样6次，分别测得峰面积并计算RSD值，检测仪器的精密度。结果如表1所示，RSD为0.65%，表明仪器精密度良好，满足实验要求。

表1 精密度实验结果

2.4 稳定性实验

取同一样品，分别于 0，2，4，6，8，10，12 h 进样，检测并记录峰面积，检测样品溶液的稳定性，结果如表2所示。RSD为0.79%，表明该样品溶液在0～12 h 内较为稳定。

表2 稳定性实验结果

2.5 加标回收实验

采用外标法检测回收率。选择已知浓度的提取物样品溶液，向其中加入一定量标准工作液，制成低、中、高三种浓度加标回收样品。按50 µL进样量进样，平行测定3次，根据结果计算磷脂酰胆碱的回收率及其RSD值。结果如表3所示，在低、中、高三种浓度下加标回收率在98.37%～103.62%之间，平均加标回收率为100.39%，RSD为1.67%，表明该方法准确，满足实验要求。

表3 加标回收实验结果

2.6 样品检测

按照1.3.4中的方法平行配置6份样品溶液，以50 µL进样量进样，检测峰面积并代入线性回归方程中计算磷脂酰胆碱含量，结果如表4所示。结果表明，按本实验方法提取的大豆粗提物中磷脂酰胆碱含量为16.31%。

表4 样品检测实验结果

3 结束语

本实验建立了一种基于氨基色谱柱，利用高效液相色谱检测大豆提取物中磷脂酰胆碱的方法。经该方法检测，无水乙醇提取的大豆提取物中磷脂酰胆碱的含量为16.31%。经过方法学验证，该方法加标回收率在98.37%～103.62%之间，准确度较高，且具有较高的精密度和良好的稳定性。目前，大多数磷脂酰胆碱的高效液相色谱检测方法的流动相采用三元体系，较为繁琐，保留时间也较长。本实验以乙腈-水二元体系作为流动相，操作简单便捷；磷脂酰胆碱的保留时间在6 min内，缩短了磷脂酰胆碱的保留时间，检测效率高。本实验结果可丰富卵磷脂中磷脂酰胆碱的检测方法，为磷脂酰胆碱的高效检测提供参考。