大蒜辣素前体微丸片的制备及其体内评价

陶 娟，苏艳慧，周 圆，郑春丽*

（1江苏护理职业学院药学与中药学院，淮安 223005；2中国药科大学药剂系，南京 210009）

由于大蒜辣素在自然状态下稳定性差，温度、pH 和溶液环境等因素都易导致大蒜辣素降解［7］，目前上市的大蒜制剂的主要成分为大蒜粉或大蒜油。通过高温蒸馏提取得到的大蒜油，仅包含不稳定的多硫化物和其他挥发性硫代烯丙基，并不含有大蒜辣素［8］。新鲜大蒜经冻干得到大蒜粉，由大蒜粉制成的大蒜片剂或胶囊等蒜粉制剂的有效成分为蒜氨酸和蒜酶。蒜氨酸是大蒜辣素性质稳定的前药，所以蒜粉制剂产生大蒜辣素的量主要取决于蒜酶的活性。蒜酶的活性受温度、pH 和辅酶因子5′-磷酸吡哆醛（PLP）等多种因素影响，它在pH 低于3.5 的胃液中立即被破坏［9］，直接口服蒜粉制剂后大蒜辣素的生成量极低。

为获得较高大蒜辣素转化率的大蒜制剂，目前通常将蒜粉制剂用肠溶薄膜材料包裹制成大蒜肠溶片。该方法虽然保护了蒜酶在胃中的活性，但体外溶出中大蒜辣素转化率较低（＜30%），这主要是因为大蒜肠溶片需进入小肠后崩解，导致蒜酶和蒜氨酸接触不充分［10-11］。此外，还可向大蒜制剂中加入一定量控酸剂用以中和胃酸从而避免蒜酶失活。周圆等［12］制备了大蒜辣素前体包芯片，通过控酸外层克服胃酸的酸性环境生成大蒜辣素，但该包芯片的制备工艺较复杂难以工业化生产。本研究提出一种新型含控酸剂的pH 调节释放微丸片，即分别将蒜氨酸、蒜酶和控酸剂制成微丸并压制成微丸片，该片剂在胃液中迅速崩解，其中控酸微丸可将胃液的pH 调节至3.5 以上，从而克服由于胃环境低pH 引起的蒜酶活性降低。本研究制备了大蒜辣素前体微丸片，并对其溶出速率和体内降血脂作用进行了研究。

1 材 料

1.1 药品与试剂

蒜氨酸（含量98%）、蒜酶（比活力1 235 U/g）（新疆爱乐欣药业有限公司）；微晶纤维素（MCC101）、PlasdoneTM聚维酮（PVP）K29/32（美国国际特品公司）；羧甲基淀粉钠（CMS-Na，德国JRS公司）；甲醇（HPLC 级，山东禹王化学试剂有限公司）；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）检测试剂盒（南京建成生物试剂研究所）；柠檬酸钠（SC-Na，南京化学试剂有限公司）；其余化学药品均为市售分析纯。水通过重蒸馏纯化，并预先通过0.22 μm的膜滤器（中国中信滤器有限公司）过滤。

1.2 仪 器

挤出滚圆造粒机、JHQ-100流化床干燥机（中国联合药物研究所）；DM Lp偏光显微镜（德国Leica公司）；TDP1.5 型单冲压片机（上海第一制药机械厂）；JSM-6360LV 型扫描电镜（日本电子株式会社）；ZRS-8G 智能溶出仪（天津海益达科技有限公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.3 动 物

SPF 级SD 大鼠，雄性，体重（250 ± 20）g，由南京青龙山动物养殖场提供，合格证号：SCXK（苏）2011-0003。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 微丸的制备与表征

2.1.1 控酸盐的筛选 以Na2CO3、NaHCO3、Ca（OH）2和SC-Na 为候选控酸组分，将上述控酸盐中2 种或3 种进行组合，考察不同质量配比控酸盐组合的控酸能力。将控酸盐组合过100 目筛5次，混合均匀后将其投入人工胃液150 mL中搅拌溶解，并记录其将胃液pH调为5~6时控酸盐的消耗时间和消耗量。

2.1.2 微丸的制备 3 种微丸的处方（100 g）见表1。称取处方量原料粉末过100 目筛混匀，加入50 μg/mL PVP 水溶液或水作为黏合剂。通过挤出滚圆造粒机制备微丸，并在流化床干燥机中干燥30 min。将含有蒜氨酸、蒜酶和控酸剂的颗粒干燥温度分别设为50 ℃、30 ℃和40 ℃。筛选粒径范围为380~550 μm的微丸进行压片。

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Table 1 Formulation of antacid pellets,alliin pellets and alliinase pellets

2.1.3 控酸微丸体外抗酸实验 本研究采用Rossett-Rice 实验［13］考察控酸微丸的控酸效率和控酸时间。将0.1 mol/L HCl 70 mL 与水30 mL 的混合溶液维持在37 ℃模拟基础胃酸。在磁力搅拌器上搅拌同时以2.0 mL/min 的速度向其中加入0.1 mol/L HCl，以模拟胃部蠕动和胃酸分泌过程。分别将控酸微丸200，300，400 和500 mg 加入烧杯中同时记录pH随时间的变化。

2.1.4 微丸圆整度的测定 使用偏光显微镜获得微丸的图像，采用Image-ProPlus 6.0图像处理软件进行分析，获得圆整度。

2.2 微丸片的制备

大蒜辣素的转化率取决于制剂中蒜氨酸与蒜酶的比例。将蒜氨酸微丸/蒜酶微丸按不同的质量比例（2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2）制成微丸片。将包含蒜氨酸微丸100 mg 的微丸与控酸微丸500 mg 和微晶纤维素140 mg 混合均匀，使用单冲压片机将混合物压制成片剂。通过溶出度试验检测大蒜辣素的转化率以确定该比例。微丸压片后，通过扫描电子显微镜观察微丸片的横截面。

2.3 微丸及微丸片体外溶出实验

2.3.1 蒜氨酸含量测定 色谱条件：C18反相色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-磷酸缓冲溶液（pH 5.0）（5∶95）；柱温：25 ℃；流速：0.5 mL/min；检测波长：205 nm；进样量：20 μL。采用外标法进行定量，配制50 μg/mL 蒜氨酸标准溶液为外标溶液。

2.3.2 大蒜辣素含量测定 色谱条件：C18反相色谱住（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%甲酸（60∶40）；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：242 nm；进样量：20 μL，采用内标法进行定量，内标为20 μg/mL 羟苯乙酯与溶出样品按1∶1 比例混合的混合溶液。大蒜辣素转化率（yn）的计算见公式（1）：

式中：V0为溶出介质的体积，Vw为溶出样品体积，c为大蒜辣素的浓度，QAlliin是蒜氨酸在片剂中的初始含量，MAllicin和MAlliin分别为大蒜辣素和蒜氨酸的相对分子质量，数字2 表示需要2 个蒜氨酸分子才能生成1个大蒜辣素分子。

2.3.3 体外溶出实验 取微丸或微丸片按《中华人民共和国药典》（2020 版）四部通则0931 第三法测定溶出度，以脱气水或pH 1.2 的人造胃液150 mL 为溶出介质，转速为75 r/min，依法操作，分别在5，10，15，20，30，45，60 min 取出溶液3 mL 后通过0.45 μm Millipore 过滤器过滤，并及时补充相同温度相同体积新鲜配制的溶出介质。采用HPLC 分析样品中的蒜氨酸和大蒜辣素的浓度。

2.4 大鼠降血脂实验

选取雄性SD 大鼠24 只，适应环境5 d 后将大鼠随机分为对照组（control）和模型组（model）。以正常大鼠饲料饲养对照组，以含有1%胆固醇的高脂饲料饲养模型组。每两周对大鼠进行眼底取血，将血液与肝素混合并以4 000 r/min离心15 min以获得血清，根据试剂盒要求分别检测血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 含量，总血脂胆固醇高于正常指标20%的为造模成功。1 个月后将造模成功的18 只高脂血症大鼠随机分成3 组：模型组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。由于片剂尺寸较大，大鼠口服给药较困难，因此采用将微丸装入胶囊中给药。对照组和模型组给予仅含有微晶纤维素的空白微丸胶囊；试验Ⅰ组服用含有蒜氨酸微丸（37 mg/kg）和蒜酶微丸（55.5 mg/kg）的胶囊；试验Ⅱ组服用含有蒜氨酸微丸（37 mg/kg）、蒜酶微丸（55.5 mg/kg）和控酸微丸（44 mg/kg）的胶囊。连续给药2 个月后收集血液。采用SPSS 16.0 软件对体内实验数据进行统计分析。

3 结 果

3.1 微丸的制备与表征

3.1.1 控酸盐的筛选 为了在短时间内使胃酸的pH 高于3.5，以保持蒜酶的活性，筛选了几种不同控酸盐的组合以及每种组合中控酸盐的质量配比，最终的筛选结果列于表2。在所有组合中，同时使用NaHCO3和SC-Na可以在最短时间内以最少的量将人工胃液的pH 调节至所需水平。因此，选择NaHCO3和SC-Na 作为控酸微丸中的控酸盐组合。

3.1.2 控酸微丸体外抗酸实验 Rossett-Rice 试验结果如图1 所示。当加入控酸微丸的质量为400 mg 或更高时，可将人工胃液的pH 调节到4 以上。加入控酸微丸500 mg 在1 min 内可以将人工胃液150 mL 的pH 调节至4，并使其pH 5~pH 6 之间维持30 min。

Table 2 Weight proportion of salt combinations and time needed to neutralize 150 mL simulated gastric fluid to pH 5-pH 6

Figure 1 Plots of pH vs time for different amounts of antacid pellets in Rossett-Rice test

3.1.3 微丸圆整度 微丸的圆整度是影响微丸压片后混合均匀度的关键参数。圆形对象的圆度值等于1。计算对象的圆度值越接近1，表明其圆整度越好。在偏光显微镜下观察到的微丸图像如图2 所示。从外观来看，所有微丸图像都接近圆形。蒜氨酸微丸的圆度值为1.349，蒜酶微丸为1.134，控酸剂微丸为1.245，均接近1，表明3 种微丸的圆整度良好。

Figure 2 Images of pellets under polarized light microscopy

3.2 控酸微丸片的微观形态

图3 为控酸微丸片横截面的扫描电镜照片。控酸微丸由于含有赋形剂的比例较小，与片剂中的其他两种微丸相比控酸微丸的硬度较低，在压片过程中被压碎并散布在其他两种微丸中，可以发挥缓冲微丸的作用，避免蒜氨酸与蒜酶微丸直接接触并保持完整。

Figure 3 SEM micrograph of a cross section of allicin pro-drug tablet containing antacid pellets

3.3 体外溶出实验

3.3.1 微丸片中蒜氨酸和蒜酶比例的确定 国际上采用潜在大蒜辣素含量（potential content of allicin）为大蒜及其相关品种的检测指标，潜在大蒜辣素含量为在水中加入大蒜粉或碎蒜片可获得的最大蒜辣素转化率［14］。因此在本研究中选择大蒜辣素转化率作为溶出度研究中片剂的评价标准。微丸片中含有不同比例蒜氨酸和蒜酶微丸时大蒜辣素的最大转化率结果如图4 所示。从结果可以看出，当蒜氨酸微丸和蒜酶微丸比例为2∶1时，大蒜辣素转化率只有15%，随着蒜酶比例上升，大蒜辣素转化率也逐渐升高，当两者比例达到1∶1.5 时，转化率可达到90%以上，比例为1∶2 时，大蒜辣素的转化率不再增加，因此将微丸片中蒜氨酸微丸和蒜酶微丸比例固定在1∶1.5。

Figure 4 Allicin yield on different ratio of alliin pellets to alliinase pellets from tablets in simulated gastric fluid(± s,n = 6)

3.3.2 微丸溶出实验 图5为蒜氨酸和蒜酶微丸（1∶1.5）在水和人工胃液中的溶出曲线。在水中，大蒜辣素的转化率超过90%，蒜氨酸的溶出度极低（图5-A）。然而，在人工胃液中，由于大部分蒜酶在低pH 条件下被破坏，因此几乎没有蒜氨酸被催化形成大蒜辣素。大蒜辣素的转化率低于5%，蒜氨酸的溶出度高于90%（图5-B）。

Figure 5 Dissolution and yield profiles of combination of alliin pellets and alliinase pellets (1∶1.5)in water(A)and in artificial gastric fluid(B)(xˉ±s,n = 6)

3.3.3 微丸片溶出实验 当将不含控酸微丸的微丸片放入人工胃液中时，蒜酶失去活性无法将微丸中的蒜氨酸转化为大蒜辣素，大蒜辣素的转化率极低。将含控酸微丸的微丸片放入人工胃液中后，保护了蒜酶的活性，30 min 后大蒜辣素的转化率上升到90%以上（图6）。

Figure 6 Yield profiles of allicin in tablets with or without antacid pellets(± s,n = 6)

3.4 体内降血脂研究

大鼠高胆固醇饮食饲喂1 个月后，模型组的TC、TG、HDL-C、LDL-C 4项指标水平均显著高于对照组（P＜0.05），且TC 和TG 指标均上升了20%以上，表明成功建立了大鼠高脂血症模型。

按给药方案连续给药2 个月后测定4 组大鼠的血清脂质水平，结果如图7 所示。与对照组相比，由于长期供应高脂饮食，模型组的4 项指标显示出极显著差异（P ＜0.01）。与模型组相比，试验Ⅰ组中的4 项指标几乎没有变化。试验Ⅱ组中的TC、TG 两项指标均显著下降，LDL-C 指标有下降、HDL-C 指标变化不大。试验Ⅱ组的结果与Steiner等［15］的研究一致，即大蒜辣素对高血脂症中TC 和TG 有明显疗效，而对HDL-C 和LDL-C 效果不显著。因此，从上述结果中可以看出，含有控酸微丸的试验Ⅱ组的疗效优于不含控酸微丸的试验Ⅰ组。

由于试验Ⅰ组和试验Ⅱ组之间的血流动力学基线水平不同，因此可以通过计算给药后血清脂质水平的变化反映出两种微丸组合对高脂血症大鼠的影响。如图8 所示，试验Ⅰ组中4 个指标的变化小于10%。但是，试验Ⅱ组中的最大变化率增加到46%（TG），并且所有血清脂质水平都恢复到或稍高于建模前的水平。可以观察到两个试验组之间存在显著差异（P＜0.05）。这些结果表明，控酸微丸能避免大鼠胃中胃酸对蒜酶活性的影响，生成更多的大蒜辣素。控酸微丸能将大鼠的胃酸pH调节至适当水平，提高大蒜辣素的转化率，对高脂血症的治疗显示出积极的治疗效果。

Figure 7 Serum lipid levels in each group of rats after drug administration for two months (± s,n = 6)

Figure 8 Changes of serum lipid levels in group I and group II after drug administration(± s,n = 6)

4 结 论

本研究将蒜氨酸和蒜酶微丸与控酸微丸混合并压片制成大蒜辣素前体微丸片，体外溶出实验结果表明在微丸片中加入控酸微丸能够调节人工胃液环境满足蒜酶催化活性的pH，从而保护蒜酶在人工胃液中的活性、提高大蒜辣素转化率至90%以上。大鼠体内降血脂研究结果证明，控酸微丸保护了蒜酶在大鼠体内的活性，产生较高转化率的大蒜辣素，从而使含控酸微丸的微丸片与不含控酸微丸的片剂相比具有较好的降血脂作用，为大蒜辣素临床应用提供了一种高转化率且易于产业化的制剂方法。