植物组织培养中抗污染培养基新配方研究

裘晓梅

（山西省桑干河杨树丰产林实验局，山西 大同 037006）

0 引言

就目前而言，植物组织培养技术属于生物学研究重点，并且应用十分广泛，能够在为植物学科研工作开展提供保障的基础上，有效优化植物生产。而污染率对于应用植物组织培养技术具有重要意义。以往行业主要通过对外植体进行消毒，并配合规范性操作，有效降低感染率，但是该方法存在耗时长的问题，并且仍无法实现对污染率的彻底控制，因此，强调行业应高度重视培养基抗污染工作，采取有效手段，在降低实验室资源浪费的同时，最大程度上降低污染率。

1 实验背景

既往研究显示，培养基使用常见抗生素包括青霉素、利福平、头孢霉素等，均具有一定的抗菌效果，而代森锰锌、百菌清在触杀真菌效果方面优势显著。多菌灵属于内吸型抗菌药物，益培灵属于抗污染复合药物。有研究表明，通过将益培灵应用在相关培养基实验中，能够起到良好的抗菌处理效果，但是在长期研究过程中发现，上述药物抗菌效果均具有一定的局限性。例如，青霉素虽然不会对外植体产生较大的影响，但是因为其具有易分解的特性，使用后药效时间相对较短，并且使用成本较高。多菌灵触杀功能相对较差，并且在使用药物后药物生效时间相对较晚，利福平、头孢霉素虽然具有一定的杀伤性，但是在单一使用的情况下，则需要加大剂量，并且上述药物均需要建立在严格的组织培养下，才能够取得抗菌效果。还有研究显示，上述药物均对于细菌能够起到良好的抑制作用，在真菌污染方面抑制效果相对较差，并且需要耗费大量资金成本。因此，强调行业应加大对培养基抗菌研究工作，确保培养基抗菌效果[1]。

2 实验材料

本文实验使用材料包括甘薯组、烟草组培苗、拟南芥种子等。

3 实验方法

3.1 配方筛选

本文在确定基础培养基为MS 培养基后，经灭菌处理，共获取12 种抑菌剂配方，详见表1。所有配方均不添加封口处理，在25℃下保存15d，每个配方配套6 皿，并对杂菌生长情况进行观察，完成抑菌剂配方筛选。在获取到最佳配方后，应逐步减少药剂浓度，确保在最低药剂浓度下筛选出最佳抑菌剂配方。

表1 MS 培养基

3.2 拟南芥种子萌发实验

取MS 培养基、MS 培养基（去除抑菌剂）、MS 培养基（CK）展开研究，取拟南芥种子，经1min 酒精消毒后，使用清水将拟南芥种子进行清洁，次氯酸消毒清洗后，放置在培养基中，每皿6 次，共计72 粒种子，在点播结束后，封口培养，观察种子萌发、污染情况[2]。

3.3 甘薯组培苗再生影响实验

取1 号配方作为实验组，取MS 培养基（不存在抑菌剂）作为对照组，保持实验室无菌环境，经45d 培养后，获取甘薯茎段。每个培养基可添加三个茎段，在保持无菌环境的基础上，对培养基进行为期一周的培养，其中，要求应将实验室温度控制在24℃，并将湿度控制在55%，观察各组污染情况，记录各组茎段生长情况。

3.4 烟草叶片诱导愈伤组织情况

取配方1 愈伤培养基作为实验组，取愈伤培养基（不存在抑菌剂）作为对照组（CK），对烟草叶片培养30d，将烟草叶片切为叶盘，并在愈伤培养剂中进行培养，要求每皿培养基至少存在五个叶盘，并在遮光条件下进行15d 培养，拍照记录，观察培养基杂菌污染情况，并对叶盘愈伤组织进行观察[3]。

3.5 甘薯组培材料验证实验

工作人员应提前准备已经受到污染的甘薯组培苗，进一步对该组培苗污染源进行判断，如果外植体侵染病症较为明显，则视为侵染性污染，反之则为非侵染性污染，借助灭菌水，对茎段进行清洗，并将茎段分为两个茎节，经酒精消毒后，使用灭菌水进行清洗，并放入配方1MS 培养基中。当存在侵染性污染时，则进一步进行酒精消毒，并将外植体暴露在空气中，使用多菌灵粉末进行涂抹，并放置在多菌灵药液中，完成浸润处理，并进一步放置在配方1 培养基中，培养时间为10d，培养温度为24℃，培养湿度为55%，观察培养基存活率、污染率。

3.6 灭菌保存实验

取甘薯茎段，灭菌预处理，并将其放置到配方1MS培养基中作为实验组，选择不进行灭菌预处理的药液包衣添加到MS 培养基中作为对照组，观察两组材料保存效果[4]。具体操作如下：取甘薯幼嫩茎段，并对茎段侵染源情况进行检查，去除掉侵染源茎段，清水冲洗切除，使其长度在3cm 以内，保持粗度在0.5～1.0cm 范围内，并每个茎段保留茎节一个，如果茎段粗度超过0.5cm，则需要保留两个茎节，酒精漂洗，清水冲洗，去除虫卵，暴露茎段，并按照配方1 配比后，放置培养，观察茎段存活率、污染率。

4 实验结果

4.1 配方筛选结果

经本文研究，配方45d 内未出现杂菌污染情况，进一步展开实验，在不改变处理条件、时间的情况下，通过合理控制变量，可获取最佳浓度。具体可逐步降低头孢霉素浓度，研究结果显示，当头孢霉素浓度达到20mg/L 时，存在细菌污染情况，剂量相对较少，因此，本文实验最终确定头孢霉素为25mg/L。逐步降低代森锰锌浓度，将浓度达到20mg/L 时，将会出现真菌污染。因此最终确定最佳配方为头孢霉素（25mg/L）、代森锰锌（30mg/L）、百菌清，混合比例为1:1。

4.2 拟南芥种子萌发影响

分别取上文配方（处理1 组）、最优配方核心药剂MS 培养基（处理2 组）以及不存在抑菌剂MS 培养基（对照组），观察拟南芥种子萌发情况。实验结果表明，经处理后，7d 内，三组均未发现杂菌情况，但是与处理2 组、对照组相比，处理1 组拟南芥种子萌发速度提升显著，但是在最终萌发率方面，处理1 组与对照组无明显差异。经研究显示，处理2 组能够提升种子前期萌发速度，但是在最终萌发率方面相对较低。

4.3 甘薯组培苗再生情况

经7d 培养后，处理1 组、处理2 组、对照组甘薯组培苗均未发现杂菌污染情况。对比三组根系生长情况，对照组根系生长速度最快，处理1 组、处理2 组可起到抑制甘薯组培苗根系生长的作用，并且与处理1 组相比，处理2 组抑制情况更加明显，与对照组相比，经处理1 组、2 组培养后，可有效提升组培苗叶数，有利于优化组培苗生长势态。

4.4 烟草叶片诱导愈伤组织情况

分别应用处理1 组、2 组以及对照组对烟草叶盘进行培养，培养需要在遮光环境下进行，培养时间为15d。结果显示，经处理后，叶盘均未出现杂菌情况，在培养第5d，可在对照组中观察到叶片膨胀情况，在实验组中，叶片尚未形成翻卷情况，但是存在拱起现象。在第15d，对照组可发现明显白色愈伤组织，但是在处理1组、2 组中，可发现少部分叶片愈伤现象。这说明通过采取最优抑菌剂，可有效抑制烟草叶盘诱导愈伤组织。

4.5 已污染甘薯组培苗再生情况

经研究表明，通过采取药液包衣预处理，将已经存在污染情况的甘薯茎段添加到处理1 组MS 培养液中，经10d 培养，可有效缓解甘薯植株污染情况。同时，处理1 组培养液能够对该培苗根系生长进行抑制。提示，在使用药液包衣的基础上，通过使用处理1 组培养基，可有效提升污染培苗存活率。

4.6 甘薯材料灭菌保存效果

本文研究结果表明，在单纯使用处理1 组培养基培养的情况下，进入到初期阶段，外植体并不会出现感染情况，但是当培养时间达到5d 后，外植体断口处将会出现菌丝，并且在菌丝逐渐长大的情况下，培养基将会被入侵。而在使用多菌灵粉末以及药液包衣后，通过将其放入到处理1 组培养基中进行培养处理，经7d 培养后，可有效优化甘薯材料生长状态，并且在培养过程中，未出现杂菌污染现象。经多次实验后，实验结果显示，为有效提升甘薯材料灭菌保存效果，除需要做好材料选择外，还需要加强药液包衣处理，并将其放置在处理1 组培养液中进行处理，可有效提升材料存活率。其中，应将材料直径控制在0.4cm。

5 实验分析

受到杂菌污染影响，将会导致组织培养质量下降，而现有抗污染技术主要强调营造无菌操作环境，进而降低培养基培养污染，该方法虽然能够在一定程度上减少污染情况，但是往往伴随高成本的问题，并且处理耗时相对较长，在抗污染不彻底的情况下，一旦出现杂菌污染，将会严重损害培养植体。而在本文研究中，头孢霉素（25mg/L），代森锰锌（30mg/L）并与百菌清经1:1混合，可取得最佳抑菌剂配方。经研究显示，该配方能够有效降低对植体的影响，有利于在最大程度上实现成本控制，进而促进甘薯组培材料繁殖以及保存。

以往有研究以彩叶草进行研究，研究结果发现，通过配置适量浓度百菌清，对彩叶草进行处理，可有效提高叶片生长量，而在提升百菌清浓度的基础上，能够对植物根系生长起到抑制作用，但是不会对头孢霉菌产生影响。在本文研究中，通过采取最优配方，能够在一定程度对植物根系生长进行抑制，但是能够提升植物茎叶生长速度，并且具有抑制愈伤组织生长的作用。这说明百菌清在植物生长中具有重要作用。因此，针对药物存在的生根抑制情况，要求工作人员应适量添加激素进行缓解，但是在选择缓解材料过程中，应避免使用吸附类材料，以免培养基中存在的抗菌成本被吸附，导致培养基抗菌效果呈现下降状态。本文实验还发现，通过选取最优配方，能够有效优化拟南芥种子发芽速度。有研究选择不同剂量代森锰锌进行研究，判断其在种子发芽中的作用，研究结果发现，代森锰锌能够帮助部分蔬菜种子快速发芽。本文研究结果显示，在最优配方中，代森锰锌在提升拟南芥种子发芽的速度方面具有核心作用。

本研究进一步对已污染甘薯组培材料进行研究，研究结果显示，通过应用最优配方，可有效促进组培材料扩大、繁殖，并且有利于材料灭菌、保存。本文研究出一种药液包衣方法，可有效完成材料预处理工作，但是在药液包衣组成成分不同的情况下，使用情况也有所不同，如果药液包衣为多菌灵药液，其属于内吸型药物，不具有良好的菌体触杀功能，可将其应用在污染源单一的材料中，有利于提升防护效果。如果药液包衣为代森锰锌、百菌清混合液，则适用于更加复杂的污染源材料中，可有效提升抗菌效果。因此，在使用药液包衣的基础上，还应另外配合最优配方，确保在最大程度上实现污染风险防控，在单纯使用药液包衣的情况下，一旦没有对菌群进行杀灭处理，同样会增加培养基污染风险。本文研究还发现，加强甘薯材料灭菌保存具有重要意义。本文研究发现，如果茎段材料直径在0.8～1.2cm 范围内，具有较高的污染率，这主要与材料环境复杂性有关，在茎秆成熟度较高的情况下，表面具有更高的创面复杂性，也会在一定程度上增加杂菌附着、入侵风险，而当茎段直径范围在0.3～0.5cm 时，经培养后，污染率相对较低，因此，茎段最佳直径为0.4cm。

6 结语

笔者研究发现，通过将头孢霉素（25mg/L），代森锰锌（30mg/L）并与百菌清经1:1 混合，可有效提升抑菌效果。同时，本文研究还发现，在使用该配方后，可有效优化拟南芥种子萌发速率、有利于优化甘薯组培苗生长、有效抑制烟草叶片诱导愈伤组织。同时，以该配方作为参考，进一步提出药液包衣方法，有利于优化灭菌保存效果。