碱提酸沉法浸提时间对青皮中橙皮苷提取率的影响

杨莉，张艺，王琤韡

（江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013）

青皮（Citrus reticulata Blanco）为芸香科植物橘及其变种的未成熟果实之外皮，是一种常用中药。传统中医理论认为其具有疏肝破气、消积化滞的作用，可以有效治疗胸胁胀痛、疝气、乳核、乳痛、食积腹痛等一系列病症[1]。青皮中主要含有黄酮类化合物、挥发油等成分，其中黄酮类化合物以橙皮苷、川青皮素、桔皮素为主[2-3]。在黄酮类化合物中，橙皮苷因其优异的生理和药理活性而在相关技术标准中作为衡量青皮质量控制的指标性成分[4]。大量的研究表明橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗辐射、降血脂、调节心血管系统、保护神经系统等多种生理活性，是一种绿色优良的饲料添加剂，也可用于保健食品、化妆品等非医用领域，具有很高的应用价值和经济价值[5-6]。我国的柑橘资源十分丰富，最主要的出口产品就是橘片罐头，而加工废弃的果皮大部分被丢弃，既浪费资源又污染环境[7]。因此，生产一种提取方法简单，橙皮苷提取率高的粗制橙皮苷对天然物产资源合理利用，推进橙皮苷的综合应用具有重要意义。但目前青皮中的橙皮苷提取转移率普遍较低，因此，如何在低成本的基础上高效地提取出橙皮苷就成为了一个研究热点[8]。橙皮苷常见的提取方法有水回流法、碱提酸沉法、索式提取法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法等，其中碱提酸沉法是一种成本较低、工艺简单，而提取率又较高的提取方法。青皮的炮制方法、粉碎程度、提取温度、碱的种类、提取时间及料液比等因素都会影响橙皮苷的提取率。本试验研究提取时间这一因素对碱提酸沉法提取橙皮苷的影响，为优化青皮的提取工艺提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 试验材料

未成熟柑橘购自云南省昆明市市场。

1.1.2 试验试剂

橙皮苷对照品（纯度≥98%），购自济宁天之蓝生物科技有限公司。氢氧化钙、盐酸、无水乙醇、硝酸铝均为国产分析纯，试验用水为纯净水。

1.1.3 试验仪器

电子天平（FA-1004），上海力辰邦西仪器科技有限公司；双光束紫外分光光度计（UV-722），上海佑科仪器仪表有限公司；鼓风恒温干燥箱（101-2B），唯恒机械设备有限公司；予华牌循环水式真空泵（SHZ-DⅢ），长沙明杰仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 橙皮苷标准曲线的绘制

精确称取橙皮苷标准品10mg，加入10%硝酸铝溶液0.6mL，用70%乙醇定容至100mL容量瓶中。精确量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置10mL具塞试管中，并用70%乙醇将其补足至10.00mL，分别得到质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL的标准样液。以70%乙醇溶液作为对照液，用双光束紫外分光光度计在480.0nm测量各试管中溶液的吸光值。以橙皮苷质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制橙皮苷标准曲线。结果表明：橙皮苷在0.01～0.06mg/mL范围内浓度与吸光度呈良好线性关系，得到线性回归曲线方程：Y=1.1X＋0.0123，R＝0.999。

1.2.2 橙皮苷提取工艺流程

柑橘皮晾干后切碎并用搅拌机粉碎至粉末状，过60目筛，柑橘皮渣放干燥器中备用。取20g柑橘皮粉末平均分为4组，按液料比30:1加入蒸馏水，再加入0.3g氢氧化钙调节pH至碱性，室温提取0.5、1、1.5、2h。减压抽滤，润洗残渣，合并滤液。滤液用0.1mol/LHCl调节至酸性，静置12h结晶，用循环水式真空泵减压抽滤，用无水乙醇洗涤至洗涤液无色，70℃鼓风恒温干燥箱烘干，称重得橙皮苷粗提物。分别将所得橙皮苷粗提物加入10%硝酸铝溶液，分别用70%乙醇溶液定容至10mL，摇匀。用双光束紫外分光光度计在480nm测定各试管中溶液的吸光值，将所测吸光值代入标准曲线得出浸提液橙皮苷质量浓度，根据提取率计算公式可得不同浸提时间橙皮苷的提取率。重复3次取平均值。

1.3 测定指标与方法

1.3提取率

将所测吸光值代入标准曲线得出浸提液橙皮苷质量浓度，再根据以下公式计算提取率：

式中：C为测定橙皮苷质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；W为样品重量，g。

1.4 数据处理

使用SPSS 20.0软件对所有数据进行初步处理。

2 结果与分析

在不同的浸提时间下，橙皮苷的提取率见表1。由表1可知：青皮在浸提时间为0.5h与1h的橙皮苷提取率均值差异达到了显著水平，表明浸提时间对橙皮苷提取率有显著性影响。橙皮苷的提取率随着浸提时间的增长，呈先上升再下降的趋势（见图1）。由图1可知，当提取时间为1h时，橙皮苷提取率最高，达到了1.06%，而超过1h后，橙皮苷提取率开始降低，表明碱提酸沉法提取橙皮苷的最佳浸提时间为1h。

3 讨论

本试验采用传统的碱提酸沉法研究浸提时间对青皮中橙皮苷提取率的影响，碱提酸沉法的原理是利用橙皮苷含有酚羟基的特点，其在碱性条件下酚羟基开环生成盐，其水溶性增大溶解，进而在酸性条件下闭环沉淀进行分离。本研究在前期试验中对溶解橙皮苷的试剂进行了筛选，探究了传统工艺中2种常用溶剂甲醇、乙醇对橙皮苷提取率的影响。结果发现，使用甲醇溶解可在一定程度上提高橙皮苷提取率，但甲醇存在成本较高、毒性较强、环境不友好等缺点，因此本试验采用环境更友好的乙醇溶解提取橙皮苷。在溶解橙皮苷的试剂选择上，李继伟[9]等对石灰水、NaOH和70%乙醇三种常见溶剂提取柑橘皮中黄酮提取率进行比较，结果表明用石灰水提取法的黄酮提取率较高，与NaOH提取法相当，还可以有效降低杂质果胶的提取率。考虑到若将该提取工艺应用于工厂的实际生产中，NaOH提取法将增加操作时间以及成本，这将导致设备与操作成本高于该提取工艺可获得的收益，故选择石灰水作为提取溶剂。在增加提取辅料的选择上，有研究表明，添加提取辅料如表面活性剂（吐温80[10]、十二烷基磺酸钠）、果胶酶[11]与纤维素酶[12]等能够有效提高橙皮苷提取率，但增加辅料会大大增加生产成本和操作难度，且现在相关技术并不十分成熟，故本试验不添加提取辅料进行提取。本方法成本较低，操作简单，提取效率较高，所用有机溶剂量较少，适合工业生产中提高生产率降低成本。

表1 橙皮苷的提取率

图1碱提酸沉法浸提不同时间的橙皮苷提取率

青皮和陈皮中均含有橙皮苷，研究表明陈皮中橙皮苷的提取率高于青皮，最高不超过30%。目前关于青皮中橙皮苷的提取工艺研究较少，而关于陈皮中橙皮苷的提取工艺文献较多。青皮中橙皮苷的提取率与橙皮苷的炮制方法、粉碎程度、提取温度、碱的种类、提取时间及料液比等因素都有关联。赵琴等[13]在研究橙皮苷的传统制作工艺时发现，通过适当增加乙醇浓度、提高浸提温度或合理延长浸提时间可以使橙皮苷更充分地游离出来，从而提高提取率。邓敏敏等[14]用超声强化碱热浸提取柚皮中橙皮苷，通过正交试验，结果表明，显著影响橙皮苷提取率的因素大小依次为：液料比＞提取温度＞提取时间＞提取次数。本试验研究结果表明，碱提酸沉提取橙皮苷的最佳浸提时间是1h，在此条件下橙皮苷提取率是1.06%。这可能是因为碱液中的橙皮苷查尔酮对氧气较为敏感，提取的时间过长会导致大量橙皮苷查尔酮被氧化，从而降低其产品收率。本研究只对碱提酸沉法的浸提时间与橙皮苷提取率的关系做出探究，并未全面考察影响橙皮苷提取率的其他因素。其他因素对橙皮苷提取率的影响及粗制橙皮苷的抗氧化能力以及活性氧自由基的清除能力还有待进一步研究。

4 结论

本试验研究表明，碱提酸沉法的浸提时间会显著影响橙皮苷提取率，最佳浸提时间为1h，橙皮苷提取率可达1.06%。