猪源嗜酸乳杆菌La-0231分离鉴定及其特性分析

宋士良

（上海邦成生物工程有限公司，上海 201506）

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，1900年首先从婴儿粪便中分离出来，当时被命名为嗜酸芽孢杆菌(Bacillus acidophilus)。1970年经Hanson和Moquot重新鉴定、分类后，修改为现在的名称，属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌（Widyastuti等，2014）[1]。嗜酸乳杆菌是少数可以存活并定植于人或动物肠道内的益生菌之一，其在肠道内的定植能力强于其它微生物。它能竞争性地定植于小肠上皮细胞，产生细菌素和有机酸，维持肠道内低pH环境，促进肠道中微生态环境的正常化（Scapin等，2013）[2]。嗜酸乳杆菌作为动物肠道中重要的益生菌，具有维护动物肠道健康、缓解不良应激、改善饲养环境、调节机体脂肪代谢和改善畜禽产品品质等功能（胡国才等，2013）[3]。La-0231菌株分离自仔猪新鲜粪便，经16SrDNA测序及生理生化特性鉴定确认其为嗜酸乳杆菌。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 分离源仔猪新鲜粪便。

1.1.2 分离培养基MRS（含溴甲酚紫）固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸粉5g，柠檬酸氢二铵2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水定容1000mL，琼脂20g，pH6.0～6.5，0.6%溴甲酚紫1mL。

1.1.3 牛奶管保种培养基脱脂奶粉10g，酵母膏2g，葡萄糖1g，蒸馏水100mL。

1.1.4 鉴定培养基MRS固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，柠檬酸氢二铵2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水定容1000mL，琼脂20g（MRS液体培养基不加琼脂），pH6.0～6.5。

1.1.5 细菌生化鉴定管 苦杏仁苷、水杨苷、七叶灵、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖、接触酶等的细菌生化鉴定管。

1.1.6 定量抗生素纸片标准品 实验用定量抗生素纸片标准品，由中国食品药品检定研究院出品。

1.1.7 实验动物 选用健康成年ICR小鼠80只，雌雄各半，雌性小鼠体重范围17.92g～21.89g，雄性小鼠体重范围19.20g～22.79g。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化步骤

①将采集的仔猪新鲜粪便逐级稀释，取0.1mL稀释液涂布于MRS（含溴甲酚紫）固体培养基平板（下同）上，37℃兼性厌氧培养2d。

②将培养好的平板取出，选取所有菌落形态为黄色、表面湿润、平凸、边缘整齐、大小在0.5mm～2.5mm的单菌落，对应作标记，在无菌条件下挑取作记号的菌落，革兰氏染色，保留镜检形态为杆菌、两端圆、大小通常为0.6μm×1.5μm～0.9μm×6.0μm，以单个、成双或短链出现的单菌落，并将平板上保留的单菌落标记为嗜酸乳杆菌疑似菌株。

③将疑似菌株采用划线的方式转接到空白平板上，37℃，兼性厌氧培养2d，进行初步的菌株纯化。

④选取上述相同菌落形态的单菌落，再划线转接到空白平板上，37℃兼性厌氧培养2d，进一步对菌株进行纯化。反复多次，直至镜检无杂菌。

⑤选取上述相同菌落形态的单菌落，转接到保种牛奶管中，37℃兼性厌氧培养15h，2℃～4℃冰箱冷藏保存备用。

1.2.2 菌种鉴定

①生理生化特性鉴定。采用细菌生化鉴定管法测定。

②16SrDNA测序。分离、纯化菌种，委托上海美吉生物医学科技有限公司进行测序，经16SrDNA基因作为Marker片段，通用引物扩增出基因中16SrDNA序列，再进行电泳检测，使用3730XL测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与NT数据库进行比对，获得近源物信息。

1.2.3 抗生素敏感试验 采用K-B法测定。

1.2.4 菌株毒力试验

①培养物制备。将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS固体培养基上，37℃兼性厌氧培养48h；挑取单菌落转接至MRS液体培养基中，37℃兼性厌氧培养48h后，将部分培养液常温下浓缩5倍备用，其余直接供实验用。

②活菌计数。无菌吸取上述①中培养液1mL，加入9mL无菌生理盐水稀释液中混匀，并进行10倍梯度稀释，选择合适的2～3个稀释度，吸取0.1mL稀释液分别涂布于MRS固体培养基平板上，每个稀释度2块平板，置37℃，兼性厌氧培养48h，计数。

③小鼠毒力试验。小鼠80只，雌雄各半，分别随机分为4组。剂量组设置为：培养基空白对照组、培养基5倍浓缩空白对照组、培养物原液组、培养物5倍浓缩组。将受试物以0.02mL/g体重的剂量给小鼠灌胃，连续灌服3d，观察7d，记录实验过程中小鼠的中毒表现或死亡情况。

1.3 试验数据统计

以下试验数据均为2次重复的平均值，数据经过Excel 2016处理后，定量测定数据利用SPSS 21.0统计软件进行方差分析，差异显著时采用Duncan’s法进行多重比较，试验结果以“平均值±标准差（±s）”表示，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株分离鉴定

2.1.1 菌株分离纯化

试验采用仔猪新鲜粪便，逐级稀释涂布平板培养，从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手挑取单菌落，再经反复多次划线分离菌种，获得纯化菌株。该纯化菌株菌落形态、菌体显微形态和革兰氏染色特征见图1。

图1 纯化菌株菌落形态、菌体显微形态和革兰氏染色特征

2.1.2 生理生化特性鉴定结果

采用划线的接种方式，将牛奶管中保存的菌种，转接到MRS固体培养基平板上，37℃兼性厌氧培养2d，进行菌种纯化。挑取培养好的单菌落，转接到MRS固体培养基平板上，37℃兼性厌氧培养2d，收集培养好的菌苔，进行菌种的细菌生化管鉴定。鉴定结果见表1。

表1 嗜酸乳杆菌La-0231菌株细菌生化管鉴定结果

从表1的检测结果可以看出，La-0231菌株能利用葡萄糖产乳酸；接触酶阴性；能在pH4.5，15℃～45℃温度环境下，厌氧或好氧生长；能发酵牛奶产酸凝固；能利用苦杏仁苷、水杨苷、七叶灵、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖等碳水化合物产生乳酸。生理生化特性鉴定为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

2.1.3 16SrDNA测序结果

采用划线的接种方式，将牛奶管中保存的菌种，转接到MRS固体培养基平板上，37℃兼性厌氧培养2d，进行菌种纯化。挑取培养好的单菌落，转接到MRS固体培养基平板上，37℃兼性厌氧培养2d。分离、纯化好的菌种，经16SrDNA基因作为Marker片段，通用引物扩增出基因中16SrDNA序列，获得其特征序列图，见图2。

从图2的测序结果可以看出，La-0231菌株其16SrDNA序列为1460bp，与嗜酸乳杆菌模式菌株KLDS 1.0701进行比对，其16SrDNA基因序列相似性达99.86%，鉴定结果为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

图2 嗜酸乳杆菌La-0231菌株16Sr DNA特征序列

2.2 菌株特性分析

2.2.1 抗生素敏感性测试结果

采用K-B法，测定嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性。检测结果见表2。

表2 嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性测试结果

从表2的测试结果可以看出，嗜酸乳杆菌La-0231菌株对青霉素、羧苄青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、克拉霉素、氯霉素、头孢曲松、头孢哌酮、呋喃妥因、头孢噻吩、头孢他啶、头孢克洛、头孢唑啉、头孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、复方新诺明敏感；对环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；对氟罗沙星、洛美沙星、诺氟沙星不敏感。

2.2.2 菌株毒力测试结果

①培养物原液中活菌计数结果

将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS液体培养基中，37℃兼性厌氧培养48h后，对培养物原液进行10倍梯度稀释，平板计数，结果见表3。

表3 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物原液中活菌计数结果

从表3的检测结果可以看出，培养物中的活菌数为2.65×108CFU/mL或2.70×108CFU/mL，两个稀释度检测结果无显著性差异（P＞0.05）。

②培养物对小鼠体重的影响

将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS液体培养基中，37℃兼性厌氧培养48h后，将部分培养液常温下浓缩5倍，其余培养液直接供试验用。分别试验对雄性小鼠体重和雌性小鼠体重的影响。结果见表4、表5。

表4 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性小鼠体重的影响

从表4的检测结果可以看出，雄性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应的对照组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即在试验期间，嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性小鼠体重无影响。

表5 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雌性小鼠体重的影响

从表5的检测结果可以看出，雌性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应的对照组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即在试验期间，嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雌性小鼠体重无影响。

③活菌对小鼠毒性作用结果

将受试物以0.02mL/g体重的剂量给小鼠灌胃，连续灌服3d，观察7d，记录实验过程中小鼠的中毒表现或死亡情况。结果见表6。

表6 嗜酸乳杆菌La-0231菌株活菌对小鼠毒性作用情况

从表6的检测结果可以看出，以0.02mL/g体重剂量嗜酸乳杆菌La-0231菌株活菌培养物（原液和浓缩液），给小鼠灌胃，连续灌服3d，观察7d，未见受试小鼠有毒性反应或死亡情况。

3 讨论

3.1 菌株分离鉴定

张雅茹等（2017）从青海酸奶中分离出一株嗜酸乳杆菌，经细菌形态学和16SrDNA序列同源性分析鉴定确认，并对其进行了降血脂的研究[4]。吴家鑫等（2019）从广西桂林市黄洛瑶寨地区淘米水发酵液中分离得到3株嗜酸乳杆菌疑似菌株，其中3号菌株菌落形态、显微形态、革兰氏染色符合嗜酸乳杆菌特征；46项生理生化指标与嗜酸乳杆菌接近，鉴定可信度达到90%；经过16SrDNA鉴定后，其与嗜酸乳杆菌的同源性高达99%，确认其为嗜酸乳杆菌，命名为CFC-001[5]。王丽等（2017）从健康鸡肠道中分离获得3株疑似乳杆菌，并对其分别命名。通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌试验，以及耐受性试验获得一株益生效果较高的菌株S-3，通过传统的形态、生理生化方法和16SrDNA分子鉴定，确定S-3为嗜酸乳杆菌[6]。蔡熙姮等（2020）从蓝狐的肠道内容物中分离到1株优势乳酸菌，命名为ZJBF300。经菌落形态、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析将其鉴定为嗜酸乳杆菌[7]。胡国才等（2015）从仔猪新鲜粪便中分离纯化了1株嗜酸乳杆菌菌株La-5，通过逐步提高培养基酸度、胆盐浓度和培养温度，对分离菌株进行驯化，获得一株具有耐低pH、高浓度胆盐及高温特性的菌株La-5c[8]。杜志琳等（2016）从健康猪肠道内容物中分离获得5株疑似乳杆菌菌株，通过生理生化和分子生物学鉴定方法，综合确定其中一株菌为嗜酸乳杆菌，命名为HEW-A701。并对其耐酸性能、耐胆盐性能和对致病菌拮抗性能进行研究[9]。张艳萍等（2017）从健康仔猪粪便中分离获得9个菌株，通过对菌株形态及生理生化特性鉴定，得到2株疑似嗜酸乳杆菌菌株，分别命名为L102和L106，通过16SrDNA分析表明，菌株L102和L106均为嗜酸乳杆菌，并对2株菌的益生特性进行研究[10]。梁东梅等（2018）选取健康猪粪便，利用选择性培养基进行厌氧培养和单克隆纯化，共获得3株乳酸杆菌，通过生化鉴定、16SrRNA基因序列测定和同源性分析，确定其中一株分离菌株为嗜酸乳杆菌。采用牛津杯法、活菌计数法和细胞试验等研究了其体外抑菌活性、黏附性及竞争性黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的益生特性[11]。本试验从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手，分离、纯化菌种，通过生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，将其鉴定为嗜酸乳杆菌，命名为La-0231菌株。

3.2 菌株特性分析

杜金城（2017）测试了4株嗜酸乳杆菌（KLDS1.0901、1.0902、1.1003和NCFM）对10种抗生素（青霉素、阿莫西林、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平、万古霉素和氯霉素）的敏感性，结果KLDS1.0901菌株对氨基糖苷类的庆大霉素、链霉素和卡那霉素耐受，对其余7种抗生素敏感；KLDS1.0902菌株对庆大霉素和卡那霉素耐受，对其余8种抗生素敏感；KLDS1.1003菌株与KLDS1.0902菌株一致；NCFM菌株对庆大霉素、链霉素和卡那霉素耐受，对四环素和利福平中介，对其余5种抗生素敏感[12]。于鸿晶等（2019）采用最低抑菌浓度法检测嗜酸乳杆菌YIT2004菌株对抗生素的敏感性，提取YIT2004菌株基因组，用特异性引物对耐药基因进行PCR扩增。结果显示嗜酸乳杆菌YIT2004菌株对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、庆大霉素、红霉素和克林霉素敏感，对万古霉素固有耐药且其耐药性不可传递[13]。本试验采用K-B法，测定了嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性，结果显示其对22种抗生素敏感，对5种抗生素中度敏感，对3种抗生素不敏感。毒力试验测试结果说明，嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性和雌性小鼠体重无影响；以0.02mL/g体重剂量活菌培养物（原液和浓缩液），给小鼠灌胃，未见受试小鼠有毒性反应或死亡情况。

4 结论

本试验采用仔猪新鲜粪便，从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手，分离、纯化菌种，通过生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，将分离纯化菌株鉴定为嗜酸乳杆菌，命名为La-0231菌株。采用K-B法，测定了嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性，结果显示其对青霉素、羧苄青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、克拉霉素、氯霉素、头孢曲松、头孢哌酮、呋喃妥因、头孢噻吩、头孢他啶、头孢克洛、头孢唑啉、头孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、复方新诺明敏感；对环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；对氟罗沙星、洛美沙星、诺氟沙星不敏感。毒力试验测试结果说明，嗜酸乳杆菌La-0231菌株对动物安全，是一株有待开发利用的猪源嗜酸乳杆菌。