不同级别子宫颈病变与lncRNA HOTTIP和H19单核苷酸多态性的关系研究

王春桃，葛安兴，吴红雁，张学艳，杨 圣，袁红香，程艳萍，冯延璐，陆欣苑，梁戈玉

1.江苏医药职业学院，江苏 盐城 224001；2.环境医学工程教育部重点实验室，东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210009；3.盐城市第一人民医院放疗科，江苏 盐城 224001

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球女性中排名第四［1］。据统计，每年约有50万新病例，大多发生在发展中国家［2］。子宫颈癌的发生是经过宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）到子宫颈癌两个阶段的多因素多步骤长期共同作用的过程，是遗传和环境因素相互作用的结果［3］。尽管子宫颈癌的诊断和治疗已经取得了一定进展，但晚期复发、耐药等导致子宫颈癌患者的死亡率仍然较高［4］。因此，进一步探索子宫颈癌发生、发展的分子机制至关重要。长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）具有众多生物学功能，通过调控不同层面基因表达，参与多种肿瘤的形成［5-7］。HOTTIP 是从HOXA族5′远端转录的一类lncRNA，位于染色体7p15.2位点，在肿瘤的发生、发展和迁移过程中发展重要的调控作用［8］。H19是人类最早发现的lncRNA，是一种母系胚胎基因，位于人类染色体11 p15.5，全长2.3 kb，具有高度保守性和同源性，在正常成人组织中通常表达下调，但在癌组织中高表达［9］。lncRNA HOTTIP和H19的差异性表达均参与子宫颈癌的发生、发展［10-11］。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为基因组中最广泛的序列遗传变异类型，具有遗传数量大、分布广、稳定性强等特点，是公认的“第三代基因遗传标记”，在癌症的发生、发展中发挥着重要作用［12］。

近年来，研究［13-14］发现，lncRNA的SNP在肿瘤的易感性和干预肿瘤发展及预后机制中发挥重要作用，可作为肿瘤的生物标志物。目前，HOTTIP rs2067087、H19 rs2839698和H19 rs2107425的SNP与子宫颈病变易感性的相关性研究较少。本研究选取HOTTIP rs2067087、H19 rs2839698和H19 rs2107425，结合研究对象的临床资料，分析它们与不同级别子宫颈病变患者发病风险的相关性，旨在为子宫颈癌的预防和诊断提供参考。

1 资料和方法

1.1 调查对象

选择2018年11月—2020年12月江苏盐城市第一人民医院子宫颈病变患者345例作为子宫颈病变组，入组标准：经病理学检查确诊子宫颈病变，未经过放疗及化疗，无肿瘤史，有相关的临床信息者。子宫颈病变组年龄28 ～ 75岁。另收集360例同期住院的无宫颈疾病的非肿瘤患者为健康对照，年龄16～89岁。本研究经患者知情同意自愿进行，所有研究对象均知晓并签署了知情同意书，并通过医学伦理委员会批准。

1.2 基因分型检测

抽取所有研究对象外周静脉血2 mL，用EDTA-2Na抗凝管收集，使用全血基因组DNA试剂盒（美国Promega公司）提取全血DNA，操作严格按照说明书步骤要求，存放于-80 ℃冰箱保存。采用NanoDrop 1000型紫外分光光度计（Thermo，美国） 测定DNA浓度和纯度。采用TaqMan-MGB实时荧光定量PCR法进行基因分型，HOTTIPrs2067087上游引物：5′-CCTCCAAGTGGCATTGTAAAACT-3′，下游引物：5′-CCAGTATGTAAAACCGCCTTCAA-3′；H19 rs2839698上游引物：5′-TAACCAAAAG TGACCGGGATGAAT-3′，反向引物：5′-TGG AGGGGCTAGCTCGAG-3′；H19 rs2107425下游引物：5′-TTCGCCCGTGGAAACGT-3′，下游引物：5′-GATAATGCCCGACCTGAAGATC-3′。PCR扩增反应体系为10 μL反应混合液，PCR条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；60 ℃ 30 s。随机抽取8%的样本进行两次分型，以确保基因分型的准确性。

1.3 统计学处理

本研究采用SPSS 23.0软件。两独立样本t检验比较计量资料。健康对照组实际频数与预计频数之间的偏差采用Hardy-Weinberg平衡检验；子宫颈病变组和健康对照组的HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698及rs2107425等位基因频率和基因型分布通过χ2检验比较；3个位点基因多态性与子宫颈病变之间的关联性应用非条件logistic回归分析，以比值比（odds ratio，OR）及95% CI评估相对危险度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 调查对象的基本特征

本研究共纳入子宫颈病变患者345例，平均年龄（49.6±9.8）岁，其中，宫颈上皮内瘤变患者220例，按临床分期分类发现，低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）66例，高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）154例。子宫颈癌患者125例，按病理学类型分为鳞癌患者103例，腺癌患者22例；按国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）（2018）临床分期分为Ⅰ期41 例，Ⅱ期84例。对照组360例，平均（50.3±14.0）岁。均为汉族女性，两组年龄分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425位点基因分型结果

HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425的SNP基因分型结果是由该样本的SNP区段扩增测序后总reads数中等位基因频度或等位基因比例所决定的（图1）。HOTTIPrs2067087扩增测序总reads数中，C的频度0.8以上，则该样本的基因型判定为野生基因CC型；C的频度0.2以下，对应的等位基因G的频度在0.8以上，则该样本判定为纯合突变基因GG型；C的频度0.2～0.8，对应的等位基因G的频度从0.8至0.2之间，则该样本判定为杂合突变基因CG型。同样的原理得到H19 rs2839698和rs2107425的基因分型，具体分型如下：H19 rs2839698分型为野生基因CC型、杂合突变基因CT型和纯合突变基因TT型；H19 rs2107425分型为野生基因CC 型、杂合突变基因CT型和纯合突变基因TT型。

图1 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425等位基因频度Fig.1 Genotyping of HOTTIP rs2067087，H19 rs2839698 and H19 rs2107425

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

HOTTIPrs2067087在健康对照组中基因型频率分别是CC基因型（36.9%），CG基因型（49.2%）和GG基因型（13.9%）；H19 rs2839698分别是CC基因型（54.2%），CT基因型（38.1%）和TT基因型（7.8%）；H19 rs2107425的3种基因型频率分别为CC基因型（33.3%）、CT基因型（46.7%）和TT基因型（20.0%）。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示P＞0.05，表明基因型分布频率具有群体代表性（表1）。

表1 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425多态性位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验Tab.1 Hardy-Weinberg genetic balance test of HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,and H19 rs2107425 polymorphism

2.4 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425 SNP与子宫颈病变的关系

HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型及等位基因频率在子宫颈病变组和健康对照组中的分布见表2。结果表明，与健康对照组相比，HOTTIPrs2067087的GG基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05）。在隐性模型中，与CC+CG基因型相比，GG基因型患者发生子宫颈病变的频率显著增加 （OR=1.522，95% CI：1.021 ～ 2.269，P=0.039）。与C等位基因相比，G等位基因在子宫颈病变组中的频率明显高于健康对照组，差异有统计学意义（OR=1.252，95% CI：1.012 ～ 1.549，P=0.038）。研究结果未发现H19 rs2839698、rs2107425与子宫颈病变之间具有相关性（P＞0.05）。

表2 子宫颈病变组与健康对照组基因型及等位基因频数分布Tab.2 Distribution of genotype and allele frequency in cervical lesion group and healthy control group

2.5 不同年龄HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布情况

分析不同年龄HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与子宫颈病变的关系，结果未发现HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与不同年龄组的子宫颈病变具有相关性（表3）。

表3 不同年龄HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与宫颈病变相关性Tab.3 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 and cervical lesions at different ages

2.6 不同级别子宫颈病变中HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布情况

将子宫颈病变组进一步分为CIN组和子宫颈癌组，分别分析3个SNP位点与CIN组、子宫颈癌组发病风险的相关性。结果显示，与健康对照组相比，CIN组的HOTTIPrs2067087 GG基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05）。CIN组中，与CC+CG基因型相比，GG基因型发生CIN的风险显著增高（OR=1.730，95% CI：1.117-2.680）。在H19 rs2839698的子宫颈癌组的隐性模型中，与CC+CT型相比，TT基因型患者发生子宫颈癌的风险低于健康对照组，差异有统计学意义（OR=0.292，95% CI：0.087 ～ 0.976，P=0.046）。此外，未发现H19 rs2107425基因型及等位基因与子宫颈癌及CIN具有相关性（表4）。

表4 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型及等位基因在CIN组、宫颈癌组及健康对照组中的分布Tab.4 Distribution of genotype and allele frequency of HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 among CIN group,cervical cancer group and control group

2.7 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与子宫颈癌临床进展的相关性

2.7.1 不同病理学类型分层分析

分析不同病理类型的子宫颈癌患者HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布频率，结果未发现HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与不同病理学类型子宫颈癌相关（P＞0.05，表5）。

表5 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与不同病理类型的宫颈癌的相关性Tab.5 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 and different pathological types of cervical cancer

2.7.2 不同临床分期分层分析

分析HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与子宫颈癌临床分期的相关性，结果未发现HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425与子宫颈癌分期具有相关性（P＞0.05，表6）。

表6 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698 s2107425与不同临床分期的宫颈癌的相关性Tab.6 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,H19 rs2107425 and cervical cancer of different clinical stages

3 讨 论

子宫颈癌是多因素、多步骤导致的疾病，其发病机制目前尚未完全明确。寻找潜在的诊断和预测指标对提高子宫颈癌患者的生存率具有重要意义。LncRNA被发现参与生长发育、细胞增殖、分化和凋亡等各种机体调节过程，并与多种肿瘤密切相关［15］。SNP作为最常见的基因突变类型，在子宫颈癌的遗传易感性中起重要作用［16］。本研究收集了705名研究对象，包括345例子宫颈病变者和360名健康对照的血液标本及相关临床信息，旨在探讨HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698及H19 rs2107425基因多态性与子宫颈癌易感性的关系。

HOTTIP作为一种新发现的lncRNA，与人类多种肿瘤的易感性、生长、增殖及预后密切相关［17-18］。然而，目前关于HOTTIP基因多态性与肿瘤易感性的研究较少。Wang等［14］研究lncRNA HOTTIP SNP与胃癌风险和预后的关系发现，HOTTIPrs2067087的GC+GG基因型使胃癌的患病风险增加1.35倍，携带CC基因型的女性更易患胃癌，提示rs2067087基因型可能是胃癌筛查中一项具有潜在有意义的检测，尤其是对女性而言。该研究团队在先前的研究［18］中也发现，HOTTIPrs2067087的SNP能使肝癌的患病风险增加1.20倍，提示HOTTIPSNP可能作为肝癌患病风险和预后的生物标志物。Lv等［19］分析发现，与GG基因型相比，携带HOTTIPrs2067087的CC基因型患结直肠癌的风险提高了1.7倍，但未发现其与结直肠癌患者总生存期之间的关联。本研究首次进行HOTTIPrs2067087与子宫颈病变及临床特征关系的研究，结果表明，GG基因型携带者可增加子宫颈病变的风险；进一步分析发现，该位点的GG基因型主要增加了CIN的发病风险，提示该位点的GG基因型可作为CIN的早期筛查及诊断依据。同时，未发现HOTTIPrs2067087与子宫颈癌病理学类型、临床分期相关。

H19是lncRNA中的一员，参与哺乳动物早期胚胎发育，其表达量在组织器官成熟后逐渐下调。lncRNA H19表达在多种恶性肿瘤组织中重新上调，对于肿瘤的进展、转移发挥重要作用［17］。近年来研究［10，20］发现，lncRNA H19与子宫颈癌的发生、发展、治疗和预后密切相关。进一步的研究发现，H19基因多态性也可能与肿瘤易感性相关。目前已有关于H19 rs2839698 SNP与肿瘤易感性的相关报道。Yang等［21］的研究也发现，rs2839698 T等位基因携带者及CT+TT基因型的个体患胃癌的风险显著增加，rs2839698 CT+TT基因型与H19 mRNA的高表达显著相关。Wu等［22］的研究发现，H19 rs2839698 T等位基因使肝细胞癌的发病风险增加29.1%。Liu等［23］的meta分析发现，无论是亚洲人群还是高加索人群，H19 rs2839698多态性都与癌症易感性显著相关。另有研究［24］表明，H19 rs2839698多态性降低了中国汉族人群结直肠癌的发病风险，尤其是在不吸烟、不饮酒、年龄≥60岁的人和超重的人（BMI≥24）中。但是，Hashemi等［25］进行的一项meta分析未发现H19 rs2839698 G＞ A基因多态性与总癌症风险有显著相关性。H19 rs2839698与子宫颈病变的相关文献较少，Huang等［26］关于H19 rs2839698多态性与子宫颈癌易感性的研究显示，虽然H19 rs2839698 TT与子宫颈癌的一些较差的临床病理学参数相关，但不能可靠地预测患者的存活率。本研究探索了H19 rs2839698 SNP与子宫颈病变组发病风险及临床进展之间的关系，结果发现，与CC+CT型相比，H19 rs2839698的TT基因型发生子宫颈癌的风险减少了70.8%。本研究人群位于中国大陆中部地区，研究对象间存在地域差异，行为生活方式也不尽相同，可能导致子宫颈癌易感性的差异。

目前关于H19 rs2107425 SNP与肿瘤易感性的研究结论并不一致。Liu等［23］进行的一项meta分析发现，H19 rs2107425与亚洲人的癌症易感性增加有关；而与高加索人群的癌症发病风险降低相关。Wang等［13］的研究发现，H19 rs2107425 CT+TT基因型与表皮生长因子受体野生型肺腺癌患者的肿瘤进展状态相关。Wu等［22］对359例肝细胞癌患者和1 190名对照进行的研究表明，H19 rs2107425 TT基因型与肝细胞癌的发病风险显著降低相关。Yang等［27］研究发现，携带H19 rs2107425 CT+TT基因型的尿路上皮细胞癌患者发生肌肉浸润性肿瘤的风险较高，进一步的临床分析发现，rs2107425 CT+TT基因型与年龄大于65岁的尿路上皮细胞癌患者较差的疾病特异性生存率相关。H19与子宫颈病变关系的研究较少，Huang等［28］对134例浸润性子宫颈癌患者、101例CIN患者和325名对照者进行研究，结果未发现H19 rs2107425基因多态性与子宫颈癌发病风险相关。本研究探索了H19 rs2107425 SNP与子宫颈病变（子宫颈癌及CIN）发病风险及临床进展之间的关联，结果未发现H19 rs2107425 SNP与子宫颈病变易感性及临床进展之间的关系，与上述Huang等［28］的结论一致。

综上所述，通过病例对照研究，本研究结果表明HOTTIPrs2067087 GG基因型与中国汉族人群子宫颈病变风险病变增加显著相关。进一步的分析发现，主要与CIN的发病风险相关，GG基因型携带者CIN的发病风险增加了73.0%。而H19 rs2839698与子宫颈癌的发病风险相关，TT基因型携带者发生子宫颈癌的风险减少了70.8%。未发现H19 rs2107425与子宫颈癌及CIN发病风险相关。未发现HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698 和H19 rs2107425基因多态性与子宫颈癌临床病理学特征的相关性。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。