铁线莲品种耐热生理指标检测

莫健彬， 蒋昌华*

(1.上海植物园， 上海 200231； 2.上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心， 上海 200231)

铁线莲属(Clematisflorida)为毛茛科(Ranunculaceae)直立灌木、草本，木质或草质藤本，是一类观赏价值高、具有多种抗逆性的藤本植物。全世界约有铁线莲属植物335种，广泛分布于除南极洲以外的各大洲。中国铁线莲属植物极其丰富，约有147种，全国各地均有分布，大部分种类分布于华中和西南地区。铁线莲喜凉爽气候，在野生环境中常与灌木伴生。上海地区2017—2021年夏季持续的高温(35 ℃以上)天气多达1个月，严重影响了铁线莲的生长，如叶片变黄、萎蔫、脱落，茎秆还易感枯萎病，限制了铁线莲在上海地区的大面积推广应用。因此，如何提高铁线莲品种耐热性是园林工作者面临的重要任务。

本研究从上海植物园现有的铁线莲品种中初步筛选20个观赏性、耐热性均较好的品种，通过一系列耐热生理指标检测，从中筛选耐热性、观赏性都比较优良的品种，为园林绿化增添了夏花植物品种，具有较强的绿化应用前景。

1 材料与方法

本研究选取上海植物园已引种的铁线莲品种中田间耐热性能较强且有明显差异的20个品种，上盆浇透水，恢复一周。在常温(25 ℃)及热激条件下(42 ℃/5 h)分别剪切成熟度相当的叶片用作试验材料。

1.1 叶片相对电导率的检测

用直径1 cm的打孔器取样(不取中脉)，称取0.2 g样品置于20 mL的试管中，加入10 mL去离子水，真空机抽气15 min，室温下静置30 min(期间每隔5 min轻摇一次)后用DDS-11A型电导率仪测电导值。沸水中水浴保温10 min，取出冷却至室温，轻摇后测电导值，计算相对电导率，以每克鲜重占有的相对电导率表示电导值[1]。

1.2 叶片相对含水量的检测

称取0.2 g剪碎的叶片置于称量瓶中，放入烘箱中105 ℃杀青30 min，然后调至80 ℃烘至恒重，取出冷却至室温，称干重，计算相对含水量，以每克鲜重占有的相对含水量表示[2-3]。

1.3 可溶性总蛋白含量检测

0.2 g叶片按质量体积比1∶3加入提取缓冲液(50 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1DTT，0.2 mmol·L-1EGTA，pH 7.5)，在冰浴中充分研磨，4 ℃下27 000 r·min-1离心15 min，重复离心2次，吸取上清液，备用。考马斯亮兰染色法测定蛋白含量，对照Bradford法制定的蛋白质标准曲线确定样品浓度[4]。

1.4 叶片SOD活性的检测

参照蒋昌华等[5]的方法，剪取叶片0.2 g在液氮中迅速研磨成均匀粉末。约0.1 g材料于3 mL提取缓冲溶液(50 mmol L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.0，含1.0 mmol L-1EDTA，0.05% Triton X-100，2%不溶性聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成匀浆。经过10 000 r·min-15 min和16 000 r·min-120 min，4 ℃下两次离心后，取上清液进行SOD活性测定。

SOD活性测定利用SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下被·O2-还原的反应。反应液为含13 mmol·L-1甲硫氨酸(核黄素电子供体)，75 μmol·L-1氯化硝基四氮唑蓝，16.7 μmol·L-1核黄素(产生·O2-)，0.1 mmol·L-1EDTA的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.8)。在波长560 nm处，检测吸光值。SOD活性以每毫克蛋白抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位，SOD比活力是SOD总活性与蛋白含量的比值。

1.5 丙二醛含量检测

硫代巴比妥酸活性产物(TBARS)即丙二醛(molonaldehyde，MDA)，参考刘志洋等[6]方法，利用MDA和TBA反应生成粉红色化合物来测定其含量。准确称取约0.1 g材料于3 mL提取缓冲溶液(50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.0，含1.0 mmol·L-1EDTA，0.05% Triton X-100，2%不溶性聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成匀浆。经过10 000 r·min-15 min和16 000 r·min-120 min，4 ℃下两次离心后，取上清液1 mL加入3 mL 0.5%硫代巴比妥酸，90～100 ℃(沸水中水浴)，反应15 min。冷却至室温下3 000 r·min-1离心5 min，取上清液可见分光光度计下分别读取450 nm、532 nm和600 nm吸光值。计算MDA量(排除多糖干扰)，用每克鲜重中MDA的量表示。

2 结果与分析

2.1 叶片相对电导率

由表1可知，排名前12的品种在热激过程中，叶片相对电导率上升不明显，而排名后8的品种上升更为明显。电导率与细胞膜损伤程度正相关，而与品种的耐热性呈负相关[7]，说明排名前12的铁线莲品种耐热性强，而排名后8的品种耐热性弱。这些品种的耐热性由强到弱顺序为绒>直立铁线莲>丰富>卡梅西塔>阿拉贝拉>波兰精神>勇士舞>华沙女神>暗夜天使>中国红>东方晨曲>朱莉>阿柳>吉普赛皇后>爱莎>拉莫娜>如步>白王冠>索利纳>金斯托韦克。

表1 各品种热激后叶片相对电导率的变化

2.2 叶片相对含水量

表2数据表明，排名前12的品种在热激过程中，叶片相对含水量上升明显，而排名后8的品种上升不明显，甚至略有下降。叶片相对含水量与品种耐热性呈正相关[7]，说明排名前12的铁线莲品种耐热性强，而排名后8的品种耐热性弱，耐热性由强到弱的顺序为直立铁线莲>丰富>绒>卡梅西塔>阿拉贝拉>波兰精神>华沙女神>勇士舞>暗夜天使>中国红>东方晨曲>朱莉>阿柳>吉普赛皇后>拉莫娜>爱莎>如步>白王冠>索利纳>金斯托韦克。

表2 各品种热激后叶片相对含水量的变化

2.3 叶片可溶性蛋白含量

表3数据表明，排名前12的品种在热激过程中，叶片可溶性蛋白含量上升较明显，而排名后8的品种上升不明显，甚至略有下降。可溶性蛋白含量与品种耐热性呈正相关[5]，说明排名前12的铁线莲品种耐热性强，而排名后8的品种耐热性弱。它们耐热性由强到弱的顺序为绒>直立铁线莲>丰富>卡梅西塔>阿拉贝拉>波兰精神>华沙女神>勇士舞>暗夜天使>中国红>东方晨曲>朱莉>阿柳>吉普赛皇后>拉莫娜>如步>爱莎>索利纳>白王冠>金斯托韦克。

表3 各品种热激后叶片可溶性蛋白含量的变化

2.4 叶片SOD比活力变化

表4数据显示，SOD比活力在热激胁迫过程中均有上升，上升值与品种耐热性呈正相关[5]，排名前列的品种耐热性强于排名靠后的品种。它们耐热性由强到弱的次序为绒>直立铁线莲>丰富>卡梅西塔>阿拉贝拉>波兰精神>华沙女神>勇士舞>暗夜天使>中国红>东方晨曲>朱莉>阿柳>吉普赛皇后>拉莫娜>如步>爱莎>索利纳>白王冠>金斯托韦克。

表4 各品种SOD比活力的变化

2.5 叶片MDA含量变化

丙二醛是过氧化产物，不耐热品种在热激胁迫过程中产生的氧化产物越多，也就是MDA含量越高[5]。表5数据表明，排名靠前的品种越耐热。它们耐热性由强到弱的次序为直立铁线莲>绒>丰富>卡梅西塔>阿拉贝拉>波兰精神>华沙女神>勇士舞>暗夜天使>中国红>东方晨曲>朱莉>阿柳>吉普赛皇后>拉莫娜>如步>索利纳>爱莎>白王冠>金斯托韦克。

表5 各品种MDA含量的变化

3 讨论

高温是影响植物生命活动的主要外界环境因子之一，其对细胞膜体系的损伤是造成植物热害的根本机制。高温伤害对组织的损伤主要是使细胞膜受到破坏，从而引发生理、代谢及生物化学方面的功能障碍。植物在受到热激胁迫时，细胞膜的不饱和脂肪酸会发生氧化降解，导致膜的孔隙变大，细胞内离子大量外泄，从而导致组织渗出液电导率的增加，因此通过组织渗出液电导率的变化来判断细胞受害情况，是最为常用的耐热性测定方法[5]。

植物在热激胁迫条件下，叶片持水能力下降，水份流失。耐热性强的品种，其叶片保水能力较强，表现为叶片的含水量略有上升。而耐热性差的品种叶片失水更为严重，叶片含水量下降。所以，植物叶片相对含水量的变化幅度与铁线莲品种的耐热性有一定的相关性[6]。

在热胁迫开始阶段，不耐热品种即开始产生热激蛋白，而耐热品种对热激胁迫反应相对滞后。当胁迫时间延长，耐热品种的蛋白合成增加，而不耐热品种的蛋白合成在下降，表现出可溶性蛋白含量的降低[7]。在胁迫初期，氧的积累会诱导SOD比活力增加，随着胁迫程度的加剧，细胞结构和功能受到严重损伤，则SOD比活力最终会下降。耐热品种在热激胁迫过程中其SOD比活力一直能保护较高水平，抗氧化能力较强。所以，SOD活性与耐热性正相关[8]。

MDA是脂质过氧化的主要产物之一，其含量可表示脂质过氧化的程度，而且MDA本身对植物细胞具有明显的毒害作用。随着盐胁迫程度的增加，植物细胞过氧化程度加剧，过氧化产物MDA含量上升。抗性强的品种抗氧化酶活性高，抗过氧化能力强，产生的过氧化产物MDA就少，反之，MDA产量则多[8]。

上述生理生化指标在常温与热激过程中的变化趋势与铁线莲品种的耐热性相一致，也与铁线莲品种田间耐热表现基本吻合，可作为铁线莲品种耐热性筛选指标，本研究结果也可作为其他园林植物耐热性筛选指标，为园林植物耐热筛选生理指标体系的建立奠定了理论基础。