西红花球茎病变对内生真菌多样性及菌群结构的影响

任航洁， 吴启婷， 陆洁淼， 张家豪， 郑吕， 秦路平， 朱波

(浙江中医药大学 药学院， 浙江 杭州 311402)

中药西红花是鸢尾科植物番红花(CrocussativusL.)的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效，用于治疗经闭癥瘕、产后瘀阻、温毒发斑、优郁痞闷 、惊悸发狂[1]。现代医学研究发现，西红花有着抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗凝血、保护脑损伤等作用[2]。我国西红花主要分布于浙江、上海、河北、江苏、西藏、安徽等地区，国外主要分布在伊朗、新西兰与西班牙等地[3-4]。球茎腐烂病是西红花生产上常见的一种重要病害，其主要危害部位是未成熟的球茎，在重茬田、低洼田和排水不良的田块中发病较为严重，严重影响西红花球茎产量与药材质量[5]。

植物内生菌是指生活史中某一阶段或整个阶段生活在健康植物组织或细胞内，并对宿主植物没有引起明显病害症状的一类真菌[6]。植物内生真菌和宿主植物之间存在着相互依存、互利共惠的关系[7]。现有报道表明，西红花中存在数量众多的内生真菌，部分内生真菌有着抑制病原菌生长、促进宿主西红花生长等作用[8-9]。

植物体良好的内生微环境对正常生长发育至关重要，目前，针对西红花内生真菌种群结构与分布规律鲜有报道。因此，本试验在前期西红花内生真菌分离鉴定的基础上，拟分析西红花健康球茎与病变球茎在内生真菌菌群结构、多样性等方面的差异，探讨球茎病变对西红花内生微环境的影响，以期为西红花大田栽培与病害防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种材料

课题组前期从浙江建德、浙江湖州、河北保定3个产地收集了健康与病变西红花球茎，并从中分离纯化得到内生真菌380株，根据菌株的形态学特征以及通过5.8S以及ITS区片段序列进行相似性对比及系统发育分析，共鉴定了26个分类单位，归属于10个属，6个目，3个纲，2个门。其中22个分类单位(占总数的86.58%)归属于子囊菌门，4个(占15.79%)归属于担子菌门。

1.2 数据统计分析

统计物种数、物种优势度与多样性指数：物种数用来记录西红花球茎中内生真菌的种类数目；物种优势度用来判断所有内生菌群中占有优势的菌群及内生菌群的组成情况。常用相对分离频率(relative frequency，RF)体现，RF=(某类内生真菌菌株数/内生真菌菌株总数)×100%[10]。优势菌种的判定：Pi>1/S[11]。Pi即相对分离频率，i表示第i种菌落，S表示该类别中总的菌落数。多样性指数(diversity index)用来描述内生真菌的菌种数量及其分布的均匀度，常使用Shannon-Wiener多样性指数(H′)[12]与Simpson多样性指数(1-D)[13]。Shannon-Wiener(H′)=-ΣPi×lnPi；Simpson指数(1-D)=1-Σ(Ni/N)2；其中Ni为类别中第i种的个体数，N为类别中所有种的个体数。

2 结果和分析

2.1 物种数和物种组成

西红花健康球茎共有内生真菌10个属，26个种；病变球茎共有内生真菌7个属，19个种。健康球茎中，湖州产地内生真菌物种数最高，为16；病变球茎中，建德产地内生真菌物种数最高，为11(表1)。

表1 3个产地西红花球茎中内生真菌的物种数

3个产地西红花球茎在病变后内生真菌物种数均下降，其中湖州产地下降最多。病变同时影响了内生真菌的物种分布，如湖州健康球茎中分离有黏帚霉属(Clonostachys)真菌，而病变球茎中却未发现。部分真菌物种分布未受球茎病变影响，如镰刀属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和踝节菌属(Talaromyces)内生真菌在健康和病变球茎中均有分布(表2)。

表2 西红花球茎中内生真菌的物种组成

2.2 种群优势度

球茎病害影响西红花内生真菌菌群结构与种群优势度，病变后，球茎中镰刀属Fusarium的相对丰度明显增加。在属水平，河北健康球茎最优势属为踝节菌属Talaromyces(RF=50.00%)，其次为青霉属Penicillium(RF=44.12%)，病变后最优势属为青霉属(RF=42.31%)，其次为镰刀属Fusarium(RF=38.46%)；湖州健康球茎最优势属为踝节菌属(RF=38.00%)，病变后最优势属为镰刀属Fusarium(RF=43.48%)；建德健康球茎最优势属为青霉属(RF=54.05%)，病变球茎最优势属为踝节菌属(RF=48.48%)，其次为镰刀属(RF=24.24%)(表3)。

表3 球茎病变后西红花内生菌在属水平的相对丰度变化

在种水平，Fusariumoxysporum病变球茎中丰度显著升高，除建德产地外，其他产地病变后西红花球茎的最优势种从Talaromycesrugulosus变为Fusariumoxysporum(图1)。

图1 不同产地西红花优势菌种相对分离频率比较

2.3 多样性指数

球茎病变影响西红花内生真菌多样性，病变后3个产地内生真菌多样性指数均下降，其中建德产地下降幅度最大，Shannon-Wiener(H′)指数下降20.26%，Simpson指数(1-D)下降11.68%(表4)。

表4 3个产地西红花球茎中内生真菌的多样性指数

3 小结与讨论

本文对浙江建德、浙江湖州、河北保定3个产地的健康与病变球茎中分离得到的内生真菌进行了多样性与菌群结构的分析，研究发现，西红花球茎病变后内生真菌的物种数下降，物种优势度也发生了改变，病变后西红花球茎的优势种从Talaromycesrugulosus变为Fusariumoxysporum。西红花健康球茎的内生真菌多样性指数在病变后下降，内生真菌多样性的降低与镰刀菌等有害菌群的增加可能是西红花球茎病变的主要原因。

已有多项研究表明，植物病害会影响植物内生真菌的菌群结构。周琳等[14]对崇明西红花球茎根腐病进行研究，从属水平分析得出，西红花球茎中细菌和真菌群落组成和相对丰度存在明显差异。唐鑫等[15]在对天麻褐腐病的研究中发现健康天麻中的优势真菌属为被孢霉属(Mortierella)和隐球菌属(Cryptococcus)，而褐腐天麻中的优势为真菌属(Neobulgaria)、土赤壳属(Ilyonectria)和花边伞属(Hypholoma)。

西红花球茎腐烂病是西红花种植过程中最主要的病害之一，其致病菌种类繁多，如镰刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)、丛花青霉(Penicilliumcorymbiferum)等[16-17]。吴李芳[5]在对建德西红花球茎病变研究中得出茄病镰刀菌(Fusariumsolani)是主要致病菌之一。赵丽娟[2]从崇明西红花病变球茎中分离得到3种致病菌，鉴定为曲霉属(Aspergillus)的巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、镰刀菌属(Fusarium)的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和青霉菌属(Penicillium)的橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)[2]。本文分析了球茎病变后西红花内生真菌菌群结构与多样性变化，为西红花病害生物防治真菌的筛选及防治策略提供了参考依据。