玉屏风散治疗慢性阻塞性肺疾病大鼠的作用及机制

雷 雪,陈 碧,朱述阳

徐州医科大学附属医院呼吸与危重症医学科,徐州 221000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是常见的呼吸系统慢性疾病,以不完全可逆的气流受限、气道炎症反应持续激活为特征,目前尚缺乏逆转气流受限、抑制气道炎症的特效治疗手段[1-2]。中医理论认为COPD 属于“肺胀”“喘证”的范畴,病机复杂,如肺气亏虚、痰瘀阻滞等均与COPD 的发病有关[3-4]。玉屏风散是具有益气固表、补虚理肺功效的中药材,有研究报道应用玉屏风散治疗由PM2.5所致肺损伤大鼠能够改善其气道功能、抑制炎症反应[5];变应性鼻炎相关的研究则证实玉屏风散抑制炎症反应的作用与其下调核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的表达水平有关[6-7]。本研究将玉屏风散用于COPD 大鼠的治疗,旨在阐明玉屏风散治疗COPD 的作用及机制,进而为临床治疗COPD提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

显微镜（日本尼康公司）;动物肺功能仪（意大利科时迈公司）;凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

玉屏风散水煎剂[中国科学院大学深圳医院（光明）中药房];阴性对照（NC）慢病毒及NF-κB慢病毒（上海吉玛制药技术有限公司）;HE 染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）的酶联免疫吸附法试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司;NF-κB 及β-actin一抗均购自英国Abcam 公司。

1.3 动物

成年雄性SD 大鼠,许可证号SYXK（浙）2019-0003,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 动物分组及干预

为研究玉屏风散治疗COPD 的价值,将成年雄性SD 大鼠随机分为对照组、COPD 组、玉屏风散组。对COPD 组、玉屏风散组进行COPD 造模。方法:第1、14天时分别麻醉大鼠,在胸骨上方1 cm 处切开气管并注入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）200μg;第2～13天、第15～28天时将大鼠放入吸烟箱内,每次燃烧10支香烟,持续约30 min,每日2次,2次间隔4～6 h。玉屏风散组从第29天起进行干预,给予玉屏风散1.98 g·kg-1灌胃,每日1次,连续处理14 d。

为研究NF-κB 在玉屏风散治疗COPD 中的作用,将成年雄性SD 大鼠随机分为NC 慢病毒组、NC慢病毒+COPD 组、NC慢病毒+玉屏风散组、NF-κB慢病毒+玉屏风散组。NC 慢病毒+COPD 组、NC慢病毒+玉屏风散组、NF-κB 慢病毒+玉屏风散组于第1～28天时进行COPD 造模;第29天时经尾静脉注射4.0×107TU·mL-1慢病毒载体50μL,给予玉屏风散1.98 g·kg-1灌胃,1次/d,连续处理14 d。

2.2 肺功能检测

末次给药后24 h进行肺功能检测,麻醉后进行气管插管,连接肺功能仪和呼吸机,设置潮气量为10 mL·kg-1、呼吸频率为60次·min-1,记录自主呼吸状态下的肺活量（forced vital capacity,FVC）、0.1 s呼气量（forced expiratory volume 0.1,FEV0.1）、呼气峰值流速（peak expiratory flow,PEF）。

2.3 肺组织病理改变检测

完成肺功能检测后处死大鼠,收集适量肺组织,以质量浓度为40 mg·L-1的多聚甲醛固定后制做4μm 厚度的病理切片,用HE染色试剂盒进行染色,染色后在显微镜下观察肺组织的病理改变。

2.4 肺组织中TNF-α、IL-6含量的检测

收集适量肺组织,加入组织裂解液后匀浆,离心收集上清,采用BCA 法试剂盒检测蛋白浓度,采用酶联免疫吸附法试剂盒检测TNF-α、IL-6的含量,计算每毫克蛋白中TNF-α、IL-6的含量。

2.5 肺组织中NF-κB表达水平的检测

收集适量肺组织,加入组织裂解液后匀浆,离心收集上清并加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel,SDSPAG）,电泳分离不同相对分子质量的蛋白后电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜,以质量浓度为50 mg·L-1的脱脂牛奶室温孵育PVDF膜1 h,用1∶1 000稀释的NF-κB一抗或1∶5 000稀释的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜过夜,次日用1∶2 000稀释的二抗室温孵育PVDF膜1 h,最后在凝胶成像仪中显影得到NF-κB和β-actin,以β-actin的吸光度值为内参,计算NF-κB的相对表达水平。

2.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件录入数据并进行统计学分析,实验数据属于计量资料,多组间比较采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 玉屏风散对COPD 大鼠肺功能的调节作用

与对照组比较,COPD 组大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均显著降低（P＜0.05）;与COPD 组比较,玉屏风散组大鼠的FVC、FEV0.1和PEF 均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。

表1 3组大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比较 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

表1 3组大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比较 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

注:与对照组比较,*P＜0.05;与COPD 组比较,#P＜0.05。

3.2 玉屏风散对COPD 大鼠肺组织病理改变的调节作用

对照组大鼠肺组织内结构正常;COPD 大鼠肺组织内肺泡出现破裂,可见炎症细胞浸润;玉屏风散组大鼠肺组织内肺泡破裂、炎症细胞浸润较COPD 组改善。结果见图1。

图1 3组大鼠肺组织病理改变的比较（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 3 groups（HE staining）

3.3 玉屏风散对COPD 大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量及NF-κB表达水平的调节作用

与对照组比较,COPD 组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6 的含量及NF-κB 的表达水平均显著上升（P＜0.05）;与COPD 组比较,玉屏风散组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的含量及NF-κB 的表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见表2、图2。

图2 3组大鼠肺组织中NF-κB表达水平的比较Fig.2 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 3 groups

表2 3组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量的比较 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

表2 3组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量的比较 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

注:与对照组比较,*P＜0.05;与COPD 组比较,#P＜0.05。

3.4 尾静脉注射慢病毒过表达NF-κB的效果

与NC慢病毒组比较,NC慢病毒+COPD 组大鼠肺组织中NF-κB的表达水平显著升高（P＜0.05）;与NC慢病毒+COPD组比较,NC慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织中NF-κB的表达水平显著降低（P＜0.05）;与NC慢病毒+玉屏风散组比较,NF-κB慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织中NF-κB 的表达水平显著升高（P＜0.05）。结果见图3。

图3 4组大鼠肺组织中NF-κB表达水平的比较Fig.3 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 4 groups

3.5 过表达NF-κB 对玉屏风散调节COPD 大鼠肺功能的影响

与NC慢病毒组比较,NC慢病毒+COPD 组大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均显著降低（P＜0.05）;与NC慢病毒+COPD组比较,NC慢病毒+玉屏风散组大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均显著升高（P＜0.05）;与NC慢病毒+玉屏风散组比较,NF-κB慢病毒+玉屏风散组的FVC、FEV0.1和PEF均显著降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 4组大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比较 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

表3 4组大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比较 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

注:与NC慢病毒组比较,*P＜0.05;与NC 慢病毒+COPD组比较,#P ＜0.05;与NC 慢病毒+玉屏风散组比较,&P＜0.05。

3.6 过表达NF-κB 对玉屏风散调节COPD 大鼠肺组织病理改变的影响

NC慢病毒组大鼠肺组织的结构正常;NC 慢病毒+COPD 组大鼠肺组织内肺泡出现破裂、可见炎症细胞浸润;NC慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织内肺泡破裂、炎症细胞浸润较NC 慢病毒+COPD 组改善;NC慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织的病理改变较NC慢病毒+玉屏风散组加重。结果见图4。

图4 4组大鼠肺组织病理改变的比较 （HE染色）Fig.4 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 4 groups（HE staining）

3.7 过表达NF-κB 对玉屏风散调节COPD 大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量的影响

与NC慢病毒组比较,NC慢病毒+COPD 组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的含量显著上升（P＜0.05）;与NC慢病毒+COPD 组比较,NC慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6 的含量显著降低（P＜0.05）;与NC慢病毒+玉屏风散组比较,NF-κB慢病毒+玉屏风散组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的含量显著增加（P＜0.05）。结果见表4。

表4 4组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量的比较 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

表4 4组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量的比较 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

注:与NC慢病毒组比较,*P＜0.05;与NC慢病毒+COPD组比较,#P＜0.05;与NC慢病毒+玉屏风散组比较,&P＜0.05。

4 讨论

气流受限、气道炎症反应激活是COPD 的主要特征,LPS联合香烟烟雾吸入是常用的COPD 造模方法[8],本研究采用该方法造模后进行了肺功能及肺组织病理改变检测,COPD 组大鼠肺组织出现了典型的COPD 病理改变且FVC、FEV0.1、PEF 均显著降低,与既往文献[8]中关于COPD 模型大鼠肺功能及肺组织病理改变的描述一致,表明COPD 造模成功。

本研究用COPD 模型大鼠探究治疗COPD 的方法。近年,中药方剂在呼吸系统慢性疾病治疗中的价值受到越来越多的重视。玉屏风散由生黄芪、防风、炒白术组成,能够针对COPD 的中医病机发挥益气固表、补虚理肺的作用。有Meta分析表明,玉屏风散用于稳定期COPD 的治疗能够改善肺功能[9];另有临床研究表明,玉屏风散用于支气管哮喘的治疗能够起到舒张气道、缓解哮喘的作用[10]。本研究用玉屏风散治疗COPD大鼠后,观察到其肺组织的病理改变明显改善且FVC、FEV0.1、PEF均显著上升,表明玉屏风散能够显著改善COPD大鼠的肺功能及肺组织病理改变,提示玉屏风散具有治疗COPD的作用。

气道炎症反应的持续激活、炎症细胞因子的大量释放是与COPD 发病及病情发展密切相关的病理因素。TNF-α和IL-6是已知与COPD 发病密切相关的炎症细胞因子,有研究报道,COPD 患者血清中及COPD 大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的含量均显著增加[11-14]。根据现代生物医学研究的结果,玉屏风散对炎症反应具有抑制作用,变应性鼻炎相关的动物实验证实,玉屏风散对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜内TNF-α、IL-6的表达具有抑制作用[6-7];另有细胞实验证实,黄芪和白术中的活性成分黄芪多肽及白术内酯具有抑制炎症反应的作用[15-16]。本研究用玉屏风散治疗COPD 大鼠后检测到其肺组织中TNF-α、IL-6的含量明显降低,表明玉屏风散对COPD 大鼠肺组织的炎症反应具有抑制作用。

NF-κB是调控炎症反应的关键转录因子,直接参与TNF-α、IL-6表达的调控,本研究证实COPD 大鼠肺组织中NF-κB 的表达水平明显上升,与既往文献[17-20]中关于COPD 发病过程中NF-κB表达水平升高的结果一致。玉屏风散治疗变应性鼻炎的过程中对NF-κB 的表达具有抑制作用,本研究观察到玉屏风散治疗COPD 大鼠能够使肺组织中NF-κB的表达水平降低,表明玉屏风散可能通过抑制NF-κB 表达的方式改善COPD 大鼠的肺功能并抑制炎症反应。为了进一步阐明NF-κB在玉屏风散治疗COPD 中的作用,本研究通过尾静脉注射慢病毒的方式过表达NF-κB,在过表达NF-κB后进行玉屏风散干预,结果表明,玉屏风散改善肺功能及肺组织病理改变、抑制炎症反应的作用减弱,表明玉屏风散治疗COPD 的作用与抑制NF-κB的表达有关。

综上所述,玉屏风散用于COPD 大鼠的治疗能够改善气道功能、肺组织病理改变并抑制炎症反应,抑制NF-κB是玉屏风散发挥上述治疗作用的分子机制,这为今后发现COPD 新的治疗策略提供了实验依据和思路。