灵芝多糖对糖尿病性勃起功能障碍大鼠氧化应激、病理学变化及线粒体损伤的改善作用

姚晓霖，朱翮嘉

(浙江大学医学院附属第一医院泌尿外科·浙江 杭州 310003)

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是指过去3个月阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以进行满意的性交，是一种常见的临床疾病[1]。随着生活习惯和饮食结构的改变，我国的ED发病率逐年升高[2]。作为糖尿病(diabetes mellitus，DM)的常见并发症之一[3]，ED在糖尿病人群中的发病率比非糖尿病人群高出3倍[4]，近75%的糖尿病患者存在不同程度的ED，且发病年龄较非糖尿病人群更早，症状也更严重[5]。

勃起受到内皮细胞和海绵体平滑肌细胞(Corpus carvernosum smooth muscle cells, CSMCS)中诸多因素的调节。先前的研究表明，糖尿病神经病变和血管病变是糖尿病性ED的主要原因，且阴茎海绵体平滑肌细胞的过度凋亡是导致ED发生的重要机制之一[6]，线粒体损伤可引起阴茎海绵体平滑肌细胞过度凋亡[7]。5型磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase type 5 inhibitor, PDE5I)是治疗ED的常用药物，但对DM ED无效[8-9]。传统中药在糖尿病及其并发症的治疗中以整体调节为主，可改善临床症状，减少西药引起的不良反应，防止并发症的产生[10]。灵芝孢子粉水溶提取物灵芝多糖具有多种药理作用，在控制血糖、提高胰岛素敏感性、增强胰岛β细胞功能、改善糖尿病并发症方面有较好的效果[11-13]。然而，关于灵芝多糖治疗糖尿病性ED的临床与实验研究尚未见报道。本研究通过DM ED动物模型研究灵芝多糖对糖尿病性ED的作用及机制，为灵芝多糖的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 42只SPF级健康雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量(220±20)，购于上海斯莱克动物实验有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2017-0015；在标准环境下(温度：(23±2)℃，湿度：55%～70%，12 h 光/暗循环)饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司实验动物中心,动物生产许可证：SCXK(浙)2020-0024，自由饮食饮水。所有动物实验均参照实验动物保护和使用指南，并经杭州鹰旸生物科技有限公司伦理委员会批准。

1.2 实验药物 灵芝多糖 (B24477)：上海源叶生物；二甲双胍(PHR1084-500MG)：Sigma公司。

1.3 实验试剂与仪器 链脲佐菌素STZ(V900890-1G)：Sigma公司；APO(盐酸阿扑吗啡，100839)：中国食品药品检定研究院；线粒体提取试剂盒(SM0020)、BCA蛋白定量试剂盒(pc0020)：索莱宝公司；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(ml003344)：上海酶联公司；丙二醛(MDA)测试盒(20180903)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(20180904)、ATP酶测试盒(20180908)：南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液(P0013D)：碧云天；Anti-p53(AF0879)、Anti-caspase-3(AF6311)、Anti-C-myc(AF0358)、Anti-Cyto C(AF0146)：Affinity公司；Anti-β-actin(EM21002)：华安公司。CMaxPius酶标仪：SpectiaMax公司；EPS300电泳仪、VE 180C电泳槽、VE186转膜仪：上海天能公司。

1.4 模型构建 大鼠适应性饲养1 周后，禁食16 h。36 只大鼠腹腔注射 STZ(60 mg/kg)，同时将6只大鼠不做处理作为正常对照组。注射 STZ 7 d后测定空腹血糖，任意时间血糖 ≥16.7 mmol/L 为 DM模型建立成功，每周测血糖1次。糖尿病成模后用正常饲料继续饲喂8周。DM ED模型筛选：动物称重后分别放入实验铁笼中，房间灯光调暗，室内尽量保持安静，适应环境 10 min。将 APO 注射于大鼠颈部皮下皮肤松软处(100 μg/kg)。录像机观察大鼠 30 min，龟头充血、露出，包皮后退并且阴茎膨大计为勃起，未见勃起者且血糖水平(空腹)超过 7.2 mmol/L 为 DM ED 大鼠。

1.5 实验分组及给药 将成模 DM ED 大鼠随机分为以下4 组：DM ED 模型组，二甲双胍组[20 mg/(kg·d)，灵芝多糖低剂量组[100 mg/(kg·d)]和灵芝多糖高剂量组[400 mg/(kg·d)]，每组3只；另取3 只健康大鼠为健康对照组。灵芝多糖组和二甲双胍组每日分别灌胃给予灵芝多糖水溶液和二甲双胍水溶液，DM ED 模型组与正常组每日灌胃给予等剂量的生理盐水，连续灌胃8周。

1.6 观察指标及测定

1.6.1 一般状况 每日观察大鼠的精神状态、活动度、饮食饮水及排便情况，每周称重并记录体质量。

1.6.2 胰岛素水平检测 给药结束后戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死大鼠后，腹主动脉采血，离心(5 000 r/min，10 min)分离血清，按照ELISA试剂盒说明检测血清中胰岛素的水平。

1.6.3 阴茎组织病理观察 给药结束后用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，处死后立即剥离阴茎海绵体组织，取阴茎组织放入10%的中性甲醛中固定，取材包埋切片。切片经常规处理进行HE染色，光镜观察。

1.6.4 阴茎海绵体组织SOD活性、MDA 含量、Ca2+-Mg2+-ATPase活性检测 大鼠处死后立即剥离阴茎海绵体组织，取部分组织制备匀浆，按照SOD和MDA试剂盒说明方法测定阴茎海绵体组织内 SOD活性与MDA的含量。取部分阴茎海绵体组织，按照Ca2+-Mg2+-ATPase检测说明书进行实验，636 nm 处检测各样本吸光度。

1.6.5 阴茎海绵体组织p53、caspase-3、C-myc与 Cyto C蛋白 的Western blot检测

RIPA裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制剂)提取阴茎海绵体组织中的蛋白质。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移到PVDF膜，TBST洗膜后，用5%脱脂奶粉封闭1.5～2 h。然后将膜放入含一抗稀释液(p53(1∶500)、caspase-3(1∶500)、C-myc(1∶500)、 Cyto C(1∶300)和Anti-β-actin(1∶10 000))的孵育盒中于4 ℃孵育过夜。随后加入二抗在室温下反应1～2 h。化学发光仪显影后用Image J 检测条带强度。

2 结果

2.1 灵芝多糖对DM ED大鼠一般状况影响 正常组大鼠精神状态良好，动作灵活。DM模型大鼠多食、多饮、多尿、体质量增长缓慢，精神倦怠、活动减少、毛发无光泽。体质量变化见表1。

2.2 灵芝多糖对DM ED大鼠胰岛素水平的影响 见表1。

表1 各组大鼠体质量和血清胰岛素水平比较

2.3 灵芝多糖对DM ED大鼠阴茎组织病理学改变的影响 正常组大鼠阴茎海绵体由海绵体小梁和大量不规则血窦(海绵窦)构成，窦状隙中可见部分红细胞，血窦内壁被以扁平的内皮细胞。与正常组大鼠相比，DM ED组大鼠阴茎海绵体内血窦数量及小血管数量明显减少，血窦扩张充血明显，海绵体平滑肌及内皮细胞密度明显降低，内皮细胞肿胀明显。二甲双胍组、灵芝多糖高剂量组、灵芝多糖低剂量组上述病理变化均有不同程度改善，阴茎海绵体内血窦数量及小血管数量明显增加，其中二甲双胍组效果最明显。

图1 各组大鼠阴茎组织病理学变化(HE，×400)

2.4 灵芝多糖对DM ED大鼠阴茎海绵体组织SOD、MDA、Ca2+-Mg2+-ATPase的影响 见表2。

表2 各组大鼠阴茎海绵体组织SOD活性、MDA含量及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的比较

2.5 灵芝多糖对大鼠阴茎海绵体组织 p53、caspase-3、C-myc与 Cyto C蛋白表达的影响 见图2。

注：与模型组比较，★P<0.05，★★P<0.01

3 讨论

近年来，随着人们生活方式的改变和人口老龄化，糖尿病的发病率逐年增加。糖尿病具有多种慢性并发症，包括心脏病，高血压，中风和ED；其中，糖尿病与ED关系最为密切，是器质性ED的主要原因[4]。灵芝性平，味甘，归肺、心、肝、肾经，其成分中多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗糖尿病、保护机体重要器官等作用[14]。在本研究结果可见，灵芝多糖能显著增加DM ED 大鼠的体质量，升高体内胰岛素的水平，同时改善DM ED大鼠阴茎病理学改变。

氧化应激产物会导致NO生物利用度降低，进而导致DM ED大鼠勃起功能的恶化[15]。然而，过量产生的ROS阻断SOD的作用，进一步降低阴茎NO的生物利用度[15]。本研究结果发现，灵芝多糖可以显著降低DM ED大鼠阴茎海绵体组织MDA含量，增加SOD和ATP酶的活性，说明具有抗氧化应激作用。

线粒体损伤是糖尿病性ED机制研究的热点之一。线粒体是一个结构和功能复杂而敏感的重要细胞器，不仅是细胞的能量工厂，还是调控能量衰竭、细胞内钙离子超载及诱导细胞凋亡机制的重要组成部分[16-18]。研究表明凋亡是多基因和蛋白严格控制的过程，如p53、Bcl-2家族、caspase家族、C-myc等[19-20]，其中依赖caspase的线粒体途径是细胞凋亡最经典的途径之一。药物通过抑制caspase-3的活化，可以产生对糖尿病性勃起障碍的保护作用[21-22]。Cyto C是线粒体氧化呼吸的限速酶，直接参与线粒体氧的利用和能量产生。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如Cyto C等从线粒体释放出来，从而发挥抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导Cyto C的释放，具有促凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用[23-24]。本研究结果显示，灵芝多糖可以抑制大鼠阴茎海绵体组织中凋亡因子的表达，从而改善糖尿病性勃起障碍。

综上，通过本研究发现，高浓度的灵芝多糖能够通过调节DM ED 的氧化应激和减轻线粒体损伤发挥作用，为DM ED 的治疗提供了研究基础和新的方向。