益气化瘀醒脑汤对急性脑缺血模型大鼠脑组织病理学、神经细胞凋亡及氧化应激损伤的影响

史海燕，史振国，张 超，王兆蒙，葛鹤年，刘 刚

(1宁波市康复医院·浙江 宁波 315040；2浙江大学宁波医院·浙江 宁波 315010)

益气化瘀醒脑汤由川芎、地龙、水蛭等中药组成，为宁波市康复医院神经内科在《寿世保元》卷五活血汤的基础上，加减化裁形成的院内协定方，对中风类疾病临床疗效明确，但机制尚不明确。本研究旨在探讨益气化瘀醒脑汤对急性脑缺血模型大鼠脑组织病理变化的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康SD大鼠，雄性，8周龄，体质量(200±20)g，购于浙江省实验动物中心，动物许可证号：SCXK-(浙)2018-0012，室温饲养，自由饮水，适应性饲养3 d后进行实验。

1.2 药品与试剂 益气化瘀醒脑汤组成：川芎10 g、地龙15 g、水蛭10 g、郁金10 g、石菖蒲15 g、胆南星10 g、生黄芪20 g、制首乌15 g、钩藤10、仙灵脾10 g、枸杞子10 g、女贞子10 g、丹参20 g、全蝎10 g、僵蚕10 g，上述中药饮片本院中药房提供，药材加水煎煮2次，分别浓缩至含0.5、1.0、1.5 g/mL原药材药液。尼莫地平片：亚宝药业集团股份有限公司，批号：20181213，20 mg/片。水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司； HE和TTC试剂盒：武汉阿斯本生物技术有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；MDA和SOD试剂盒：碧云天生物科技有限公司；T-AOC 和GSH-Px试剂盒：武汉阿斯本生物技术有限公司。

1.3 仪器 ELx800酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；CUT4062 型石蜡切片机与包埋机：德国SLEE公司；BX60显微镜：日本Olympus Optical 公司。

1.4 模型建立及分组 将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组，模型组，益气化瘀醒脑汤低、中、高剂量组和阳性组，每组10只。除正常对照组外，其他4组大鼠5%水合氯醛麻醉，采用改良闭塞线栓法栓塞大脑中动脉法建立实验性脑缺血损伤大鼠模型[1]。大鼠右侧背部脱毛，仰卧，四肢固定于手术台板，颈部正中区域做竖形切口，钝性分离双侧筋膜及腺体，充分暴露右侧颈动脉，显微镊分离颈外动脉和颈内动脉，靠近分叉处结扎颈外动脉，距右侧颈总动脉分叉近端丝线结扎，在右侧颈总动脉远端置丝线打一活结备用，逐层缝合筋膜和皮肤，碘伏常规切口消毒。正常组除不插入线栓外其余手术过程相同。

1.5 给药方法 造模24 h后，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，益气化瘀醒脑汤低、中、高剂量组给予不同浓度的益气化瘀醒脑汤灌胃，剂量均为10 mL/kg，1 次/d，给药7 d。阳性组给予尼莫地平片，10 mg/kg，1 次/d，给药7 d。

1.6 观察指标与检测

1.6.1 神经功能损伤程度测定 末次给药24 h后评价神经功能损伤程度，采用5分法[2]。0分：神经功能正常；1分：提尾悬空前爪不能伸展；2分：行走出现向左侧转圈行为；3分：行走困难且向左侧倾倒；4分：无自主活动、意识丧失。

1.6.2 脑梗死面积 采用TTC染色测定。脑片2%TTC染色液避光孵育0.5 h，10%甲醛固定，通过Image-Pro Plus 6.0 测量，梗死组织呈白色，正常脑组织呈红色。梗死体积(%)=梗死体积/对侧大脑半球体积×100%。

1.6.3 脑组织病理观察 分别于末次给药24 h后，取脑组织，PBS清洗，甲醛固定，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，乙醇水化，HE染色，中性树胶封片，显微镜观察。

1.6.4 神经细胞凋亡测定 取左半球脑组织，4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，5 μm冠状切片，TUNEL法检测，计算凋亡指数。

1.6.5 氧化应激损伤因子测定 取血清，硫代巴比妥酸法测定MDA，水溶性四氮唑法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)，采用酶联免疫吸附法(ELISA)法按照说明书操作测定总抗氧化活力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能损伤评分和脑梗死体积比较 见表1。

表1 各组大鼠神经功能损伤评分和脑梗死体积比较

2.2 各组大鼠脑组织HE染色结果 正常组脑组织正常，脑细胞排列有序，细胞轮廓清晰、结构完整，无水肿，形态正常，未见异常。与正常组比较，模型组脑细胞明显减少，大量细胞坏死且排列紊乱，梗死灶内细胞和血管坏死、脑组织细胞疏松、形态改变、间质水肿。益气化瘀醒脑汤低、中、高剂量组和阳性组脑组织损伤减轻，细胞稍显疏松，水肿减轻。见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理学切片(HE染色，×100)

2.3 各组大鼠神经细胞凋亡比较 见表2。

表2 各组大鼠神经细胞凋亡比较

2.4 各组大鼠血清氧化应激损伤指标比较 见表3。

表3 各组大鼠血清MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px水平比较

3 讨论

急性脑缺血受到缺氧缺血的影响，导致神经细胞死亡，细胞经历脑氧化代谢受损、肿胀和细胞外兴奋性氨基酸积累，体内就会产生过多的氧化活性分子，加剧氧化损伤和组织损伤[3-4]。急性脑缺血属于中医学“中风”范畴，气虚则运血无力，血流不畅，而致脑络瘀滞不通，痰浊、瘀血既是病理产物，又是致病因素，痰瘀互阻，壅滞脑络，瘀血阻滞经脉不通，元神受损、脏腑功能失衡[5-6]。基于此病机，应治以应益气化瘀、醒脑解郁之法[7]。急性脑缺血病理生理学改变除神经细胞坏死以外，还包括缺血区及周边组织反应性的血管新生，随着缺血时间延长，出现了局部微血管损伤及反应性胶质细胞增生，导致局部组织水肿坏死[8]。脑组织缺血后，供氧中断，使氧化系统和抗氧化系统失衡，造成组织损伤，降低氧化应激反应对脑组织具有保护作用[9]。

益气化瘀醒脑汤川芎、地龙、水蛭等组成，川芎活血祛瘀、行气开郁；地龙咸寒降泄，性走窜，既能息风止痉、又善清解高热，长于通行经络；水蛭破血通经、逐瘀消癥；郁金能清热凉血、行气解郁；石菖蒲具有开窍化痰、开郁行神、醒神益智的功效；胆南星归肝、胆、肺经，具有清火化痰、息风定惊之功效；生黄芪能补一身之气，使正气充足推动血行；制首乌气微，味微甘而苦涩，具有补肝肾、益精血功效；钩藤具有息风定惊、清热平肝之功效；丹参活血祛瘀、除烦安神；全蝎息风镇痉、通络止痛、攻毒散结；僵蚕具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结之功效[10-11]。诸药共用，起到益气化瘀、醒脑开窍、化痰通络的功效，正中急性脑缺血气滞血瘀、脑络痹阻、痰瘀阻滞之病机。现代药理研究显示：方中川芎的主要活性成分为川芎挥发油，可改善大鼠神经功能缺损症状，降低脑梗死率及MDA、LD、LDH水平，提高Ca2+-ATP酶活性,抑制细胞内钙超载，抑制炎性反应等改善脑缺血再灌注损伤[12-13]。地龙可有效预防大鼠脑缺血再灌注损伤，其机制可能与增加血清SOD活性及降低LDH、MDA含量有关[14]。水蛭有扩张毛细血管、改善微循环、增加血流量的作用，通过抗炎、抑制平滑肌细胞、调控自噬、抗氧化等机制发挥治疗心血管疾病的作用[15]。

本研究发现，益气化瘀醒脑汤低、中、高剂量组和阳性组脑组织损伤减轻，细胞稍显疏松，水肿减轻，益气化瘀醒脑汤低、中、高剂量组和阳性组MDA含量显著降低，SOD、T-AOC和GSH-Px活性显著升高。综上所述，益气化瘀醒脑汤可显著降低急性脑缺血模型大鼠神经功能损伤和脑梗死体积，改善脑组织损伤，减少神经细胞凋亡，其机制可能与减轻氧化应激损伤有关。