长沙地区南瓜白粉病病原菌及种质资源抗性的鉴定

严佳丽，楚 箫，黎 豪，梁少华，孙小武

（园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心·湖南农业大学园艺学院 长沙 410128）

南瓜是葫芦科南瓜属（）一年生蔓生草本植物，是我国重要的瓜类作物，也是栽培最早的蔬菜作物之一，主要分为五大栽培种，即中国南瓜（.）、印度南瓜（.）、美洲南瓜（.）、黑籽南瓜（.）及灰籽南瓜（.）。南瓜具有极高的经济价值、营养价值、药用价值、饲用价值和观赏价值，深受广大消费者喜爱，在我国广泛种植。南瓜在我国农业种植结构调整和经济增收中起到了重要作用。自20 世纪70年代以来，随着人们食物结构的改善和对南瓜营养成分及其保健价值的深入研究，南瓜种植面积逐年扩大，南瓜生产过程中各种病害也逐年加重。白粉病是南瓜生产中的主要病害之一，白粉病具有潜伏久、发病快、蔓延迅速等特点，防治不当，轻则减产20%～30%，重则造成植株死亡，严重影响南瓜的产量和品质。

目前，引起瓜类白粉病的病原菌主要有3 个属：白粉病菌属（）、内丝白粉病菌属（）及单囊壳属（），6 个种分别是.、.、.、.、.和.。.报道最多，其次为.。.已发现有11 个生理小种，分别是生理小种0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3 和N4。

白粉病菌生理小种种类繁多，分化快。不同作物之间的白粉病生理小种相差甚远，同一作物在不同地区栽培，白粉病生理小种也不尽相同。准确预测和鉴定南瓜白粉病病原菌种类，并检测其生理小种的分化是解决南瓜白粉病防治难题的基础。2006 年刘秀波等对黑龙江地区侵染南瓜白粉病生理小种进行了鉴定，确定其为单囊壳白粉菌（.），而2009 年马鸿艳等研究表明该地区的优势生理小种由2Frace 转变为race1。随着现代分子生物技术的高速发展，基因序列比对等技术被应用于物种鉴定等相关领域，白粉病病原菌的鉴定方式也由最初的显微观察向分子鉴定方向逐步发展。包海青等、王娟等、咸丰等利用显微观察和白粉病生理小种鉴别体系的方法分别对来自海南三亚地区、北京地区、陕西关中地区的南瓜白粉病菌进行鉴定，确定白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（.），其生理小种是2France。屈淑平等、綦聪通过形态观察、分子鉴定及白粉病生理小种鉴别体系的方法，鉴定出黑龙江省哈尔滨市香坊区南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（.），生理小种为2France。李书颉等利用形态学和分子生物学的方法对内蒙古不同地区籽用美洲南瓜白粉病病原菌种类进行鉴定，确定内蒙古地区白粉病为单囊壳白粉菌（.），初步确定存在小种4、2F、1 和1 个未知小种；夏伟伟等通过形态观察、ITS 序列比对以及生理小种鉴别体系推断安徽省合肥市长丰地区的南瓜白粉病为单囊壳病菌，生理小种是race1。

湖南作为南瓜的重要产区之一，目前关于湖南地区的南瓜白粉病鉴定和抗病种质筛选的研究较少，笔者以湖南省长沙地区为例，通过对湖南省长沙市金山基地南瓜白粉病病原菌的形态结构进行观察、扩增该白粉病病原菌ITS 序列并进行比对，鉴定该地区的白粉病病原菌种类；其次采用国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主明确该地区的白粉病菌的生理小种，对90 份南瓜种质资源进行白粉病抗性鉴定，筛选出高抗白粉病的种质资源，为南瓜白粉病的抗病基因定位及培育抗白粉病新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2 份易感病自交系和90 份种质资源鉴定材料由湖南农业大学园艺学院瓜类工程技术研究中心和湖南雪峰种业有限公司提供。易感病自交系为新土佐父本（.Duch.）和蜜本（.Duch.），90 份南瓜种质资源为36 份中国南瓜类型和54 份印度南瓜类型。2019 年4 月在长沙市芙蓉区湖南农业大学旁金山基地大棚种植南瓜自交系新土佐父本和蜜本，用于病原菌分离、鉴定及白粉病接种体系优化，2019 年4 月在邵东县九龙岭镇湖南农业大学南瓜实验基地大棚种植90 份种质资源鉴定材料，用于抗性鉴定。

国际通用鉴别寄主：Iran H、Top Mark、Védrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6、Nantais Oblong，由北京大学现代农业研究院张兴平教授惠赠。甜瓜鉴别寄主均在人工气候箱中培养，用于白粉病生理小种鉴定。

白粉病病原菌取自2019 年4 月种植于湖南农业大学南瓜试验基地自然发病的南瓜植株叶片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分离纯化 2019 年5 月收集自然发病南瓜叶片白粉病单菌落，滴入2 滴吐温20，制成2.5×10～5.0×10个·mL孢子悬浮液，喷施于南瓜健康幼苗植株叶片上，后置于28 ℃、湿度80%、光照度30 000 lx、光周期为12 h 的人工气候箱中培养，经过5 次分离纯化后利用易感病品种新土佐父本植株扩繁，活体保存，用于后续试验。

1.2.2 白粉病病原菌形态观察 参照马鸿艳等的方法，利用KOH 溶液观察纤维状体，取白粉病病原菌的分生孢子于载玻片上，滴加1 滴3% KOH 溶液，盖上盖玻片，在10×40 倍光学显微镜下观察白粉病孢子中是否存在纤维状体。二孢白粉菌.的分生孢子呈细长圆柱形，没有纤维状体。单囊壳白粉菌.的分生孢子呈椭圆形，有发达的纤维状体。

1.2.3 白粉病病原菌分子鉴定 白粉病病原菌DNA 提取：用真菌DNA 小量提取试剂盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA。

ITS 序列PCR 扩增引物与程序：利用真菌核糖体ITS 区段通用引物ITS 1、ITS 4，序列为：ITS 1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS 4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 体系为50 μL 体系：DNA 模板1.25 μL，上下引物各2.5 μL，2×RapidMaster Mix（Vazyme）25 μL，ddHO 18.75 μL。PCR 反应条件为：预变性94 ℃5 min；变性94 ℃30 s，退火50 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，35 个循环；再延伸72 ℃，10 min。

凝胶电泳检测：取5 μL PCR 产物，核酸染料染色，1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。

PCR 产物测序：将PCR 产物原液送至北京擎科生物有限公司进行正反双向测序。

序列分析：将南瓜白粉病病原菌ITS 序列在NCBI 核酸数据库中BLAST 比对，使用DNAMAN软件进行序列对比分析，构建系统发育树。1.2.4 白粉病病原菌生理小种鉴定 采用国际通用的13 个甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主。通过寄主分析不同白粉病病原菌生理小种抗感反应以区别本试验中感染白粉病病原菌的生理小种，寄主对不同生理小种抗感反应表现见表1，每个鉴别寄主种植10 株。待寄主材料第3 片真叶展开时即可接种，取分离纯化后南瓜白粉病病原菌于清水中，滴加2 滴吐温20，制成浓度为2.5×10～5.0×10个·mL的悬浮液，用毛刷蘸取菌液，均匀涂抹在寄主叶片正面。接种后保持昼/夜温度26 ℃/16 ℃，相对湿度75%。接种后切忌在叶片上浇水，浇水和施肥从穴盘底部进行。接种10 d 后调查发病情况，接种叶片出现白色分生孢子层的为感病；接种叶片无症状或出现褐色坏死病斑的为抗病。

表1 甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主及其抗感反应

1.2.5 南瓜种质资源白粉病抗性鉴定 2019 年6 月在湖南农业大学瓜类工程技术研究中心邵阳基地大棚中种植南瓜材料，在成株期对90 份南瓜种质资源喷施浓度为2.5×10～5.0×10个·mL的白粉病孢子悬浮液，接种后15 d 对南瓜病情划分等级，计算病情指数，根据病情指数计算结果判断种质资源抗性表现。鉴定标准见表2，病情指数（DI）计算如下：

表2 植株抗感白粉病情况鉴定标准

式中，s为发病等级，n为相应发病等级植株数目，为调查总株数观测量。

0＜DI≤20 时为高抗材料；20＜DI≤40 时为抗病材料；40＜DI＜60 时为中间型材料；60≤DI＜80 是为感病材料；DI≥80 为高感材料。

2 结果与分析

2.1 南瓜白粉病病原菌形态特征

由图1 可知，取分离纯化后南瓜白粉病病原菌在10×40 倍的电子显微镜下观察分生孢子和纤维状体，显示分生孢子呈椭圆形。病原菌分生孢子内均含明显纤维状体。通过形态特征观察初步判断，此白粉病菌为单囊壳白粉菌（）。

图1 南瓜白粉病病原菌形态观察

2.2 南瓜白粉病病原菌分子鉴定

利用真菌DNA 提取试剂盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA，利用通用引物ITS 1、ITS 4 扩增得到长度为522 bp DNA 片段（图2）。运用DNAMAN 6.0（LynnonBiosoft）将序列与已报道侵染瓜类白粉病病原菌其他序列对比（图3），结果表明，长沙地区的白粉病病原菌与序列一致性高达99%；构建系统发育树（图4），结果表明南瓜白粉病病原菌ITS 序列相较于.、.、.而言，与单囊壳白粉病（）同源关系更近。通过分子鉴定的方法，更进一步验证了湖南省长沙市湖南农业大学金山基地南瓜白粉病病原菌种类为单囊壳白粉菌（）。

图2 南瓜白粉病病原菌DNA 扩增结果

图3 南瓜白粉病病原菌ITS 同源序列对比

图4 根据ITS 序列构建南瓜白粉病病原菌系统发育树

2.3 南瓜白粉病病原菌生理小种鉴定

甜瓜鉴别寄主Iran H、Top mark、Védrantais、PMR 45、Nantais Oblong 接种10 d 叶片出现明显白粉病斑；20 d 后植株叶片及茎干出现浓厚白粉层。而寄主PMR 5、WMR 29、Edisto 47、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6 无白粉病侵染情况，寄主PI 414723 出现极少数褐色坏死病斑，表现出较强抗病特征。对比表3 抗感反应，确认湖南省长沙市湖南农业大学金山基地白粉病病原菌生理小种为单囊壳白粉病菌中的2France。

表3 鉴别寄主对南瓜白粉病菌抗感反应

2.4 南瓜抗白粉病种质资源的筛选

由表4 可以看出，从90 份种质资源中筛选出9份高抗种质、11 份抗病种质、30 份中间型种质、20份感病种质以及20 份高感材料。其中，9 份高抗种质全为中国南瓜类型；11 份抗病种质包含3 份中国南瓜类型以及8 份印度南瓜类型；30 份中间型种质包含8 份中国南瓜类型以及22 份印度南瓜类型；20 份感病病种质包含9 份中国南瓜类型以及11 份印度南瓜类型；20 份高感种质包含7 份中国南瓜类型以及13 份印度南瓜类型。

表4 90 份不同品系南瓜抗病性鉴定

3 讨论与结论

瓜类作物白粉病病原菌在无性形态上不易区分，可通过分生孢子是否具有纤维状体区分.和.，臧全宇通过有无纤维状体的方法鉴定出杭州甜瓜白粉病菌属于.。rDNA 序列克隆分析手段已经广泛应用于病原菌的分类，其中的ITS 序列进化速度快，具有保守性，在不同的科、属、种的水平上具有特异性，因此，通过设计引物比对分析病原菌ITS 序列可有效鉴定病原菌。张怡等采集河南周口地区的白粉病病原菌分析其ITS 序列，鉴定出该地区的瓜类白粉病菌属于单囊壳白粉菌（.）。本试验中电子显微镜下的南瓜白粉病病原菌的分生孢子为椭圆形，3%的KOH 溶液着色效果下，孢子内含有纤维状体，初步判断其属于单囊壳白粉菌（.）。通过ITS 序列比对分析可知，长沙地区南瓜白粉病病原菌（图3 中HNCSJSJDLH）与、、、、及的ITS 序列高度同源，通过系统发育树分析可知，本试验中白粉病病原菌（图4 中HNCSJSJDLH）与聚类在同一分支，进一步确定长沙地区南瓜白粉病病原菌属于单囊壳白粉菌（.）。采用国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主明确鉴定出2019 年湖南省长沙地区金山基地大棚南瓜白粉病菌的生理小种为2France。

目前，国内报道的南瓜抗白粉病种质资源鉴定研究主要以美洲南瓜类型为主。张旭业从28 份美洲南瓜材料中筛选出10 份抗病材料。屈淑平等从64 份美洲南瓜材料中筛选出13 份高抗资源和15 份高感材料。笔者对收集的90 份南瓜种质资源进行白粉病抗性鉴定，得到9 份高抗种质、11份抗病种质、30 份中间型种质、20 份感病种质以及20 份高感材料。其中，高抗种质均为中国南瓜类型，感病材料多为印度南瓜类型，初步推断，可能中国南瓜在白粉病抗性方面优于印度南瓜，但仍需进一步扩大样本量进行深入研究。本试验为抗白粉病种质资源的挖掘、抗病基因定位研究以及抗病新品种的创制奠定了一定基础。