除草剂胁迫下谷子杂交种和常规种保护酶活性的比较

朱红燕，任永康，孙 然

（1.山西新威科农业科技有限公司，山西 太原 030031；2.山西农业大学 农学院，山西 太原 030031；3.山西农业大学农业经济管理学院，山西 太原 030006）

谷子原产于我国，历史悠久，享有“百谷之长” 的美称[1-2]，是人们十分喜爱的小杂粮作物。米粒营养丰富[3-5]，药用价值尚高[6]，内含10%左右的蛋白质，1.7%左右的脂肪和各类维生素和胡萝卜素以及有机元素[7]。谷子在生长过程中如遇阴雨连绵的天气便很容易形成草荒，对此又很难防治。杂草危害十分严重，不仅加大了田间作业的劳动强度，而且还严重影响了杂交谷的产量和品质，因此，研究化学除草技术势在必行[8-9]。任建跃[10]研究了除草剂处理土壤对晋谷32号谷子生物特性的影响，结果表明，乙草胺100 mL/hm2+嗪草酮3.3 g/hm2对谷子生长无影响，其余除草剂则对谷子生长发育不安全。王鑫等[11]探究了不同浓度单嘧磺隆对谷子营养价值的影响，结果表明，随着单嘧磺隆浓度的提高，谷子成熟籽粒中脂肪含量逐渐下降，总淀粉、直链淀粉、支链淀粉含量逐渐上升。武翠卿[12]研究了除草剂对谷子生长发育的影响及其杀草效果，结果表明，当植物处于除草剂胁迫条件下，晋谷32号过氧化物酶系统受伤害的程度较小，体内过氧化物酶（POD）的活性增大从而会保护或恢复膜的完整性。李萍等[13]研究了不同谷子品种对除草剂的耐受性，结果表明，施用扑草净之后，晋谷32号POD酶活性有所提高，对扑草净有一定的耐药性。解丽丽[14]研究了除草剂对谷子生长特性和产量性状的影响，结果表明，张杂谷10号POD的活性随着烯禾啶的浓度先升高后下降，得出了除草剂作用下的最适浓度。幼苗对除草剂的胁迫都是敏感的，外界胁迫下，谷子有相应的保护系统进行及时防御与应对，作为保护酶的超氧化物岐化酶（SOD），过氧化物酶（POD），过氧化氢酶（CAT）具有较强的抗氧化性，可以解离谷子内因外压产生对细胞膜等生物大分子具有破坏作用的活性氧爆发，从而预防胁迫危害，加强谷子对除草剂的抗逆性，主要表现在保护酶含量的变化上。近年来，除草剂胁迫下谷子杂交种与常规种保护酶活性比较的研究还鲜见报道。

烯禾啶杀草谱广，易溶于有机溶剂，无腐蚀性，能有效防除多种1年生杂草和多年生杂草，本研究通过2因素4水平试验，探究不同烯禾啶浓度下张杂谷5号、张杂谷13号、晋谷21号和晋谷59号中SOD、POD和CAT的保护酶含量，旨在为谷田除草剂的大面积应用和杂交谷的大力推广提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2018年5—9月进行，试验地设在山西省晋中市榆次区什贴镇山庄头村试验田（东经112.86°，北纬为37.81°），试验地前茬作物为马铃薯。该地土壤基本理化性质为：pH值8.2，有机质含量18.3 g/kg，全氮含量0.92 g/kg，碱解氮含量78 mg/kg，全磷含量0.66 g/kg，速效磷含量18 mg/kg，全钾含量25.7 g/kg，速效钾含量105 mg/kg。

1.2 试验材料

供试品种为张杂谷5号、张杂谷13号、晋谷21号和晋谷59号。试验用的除草剂是湖北恒景瑞化有限公司生产的12.5%烯禾啶乳油。

1.3 试验方法

试验采用2因素4水平完全随机设计，共16个处理组合，随机安排小区，试验区周围设保护行，每个处理重复3次。播前统一灌水，统一旋耕。待3~5叶期时根据设计密度统一间苗、定苗。待6~7叶期时，谷子分别喷施4种浓度梯度的12.5%烯禾啶乳油：0（清水对照）、1.25、2.50、5.00 mL/L。其中，2.5 mL/L为12.5%烯禾啶乳油除草剂的产品推荐使用浓度。7 d后，分别称取4个不同品种谷子的叶片待用。每个处理5个重复。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 超氧化物岐化酶（SOD）活性测定 SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[15]。取0.6 g谷子的茎叶于研钵中，加入7.5 mL的磷酸缓冲液以及少量的二氧化硅和碳酸钙，研磨成浆，过滤后加入缓冲液于10 mL离心管中离心10 min。取保护酶上清液均分在3个离心管中，分别为POD、SOD和CAT酶提取液。用上述相同的方法分别处理4个不同品种谷子4个浓度的茎叶，将酶提取液置于0~4℃的冰箱中待用。

标准组依次加入下列溶液：2 mL的磷酸缓冲液，0.2 mL的甲硫氨酸溶液，0.2 mL的氮蓝四唑溶液，0.2 mL的EDTA-Na2，0.2 mL的核黄素，0.2 mL的蒸馏水，总体积为3 mL。试验组加溶液的顺序依次为：2 mL的SOD酶提取液，0.2 mL的甲硫氨酸溶液，0.2 mL的氮蓝四唑溶液，0.2 mL的EDTA-Na2，0.2 mL的核黄素，0.2 mL的蒸馏水，总体积为3 mL。处理后将所有试管于日光灯下反应10 min。反应结束后，分别测定各试管560 nm波长下的吸光度值。

式中，A0为标准组的吸光度值；AS为试验组的消光度值；VT为反应总体积3 mL；V1为反应中SOD酶提取液的用量（2 mL）；W为谷子茎叶鲜质量（0.2 g）。

用公式（1）对16组试验数据与一组标准组数据进行计算与整理。

1.4.2 过氧化物酶（POD）活性测定 过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法[16-17]。取光径1 cm的比色杯，一支为对照组，加入磷酸缓冲液0.1 mL，反应混合液2 mL；另16支为试验组，各加入POD酶液0.1 mL，反应混合液2 mL。在波长470 nm下测定OD值，酶活性用每分钟吸光度变化值表示。

式中，ΔA为某时间内吸光值的变化量；V为提取POD酶提取液的总体积（3 mL）；W为谷子茎叶鲜质量（0.2 g）；Vt为反应中POD酶提取液的用量（0.1 mL）。

1.4.3 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用高锰酸钾滴定法[18]。试验组锥形瓶中各依次加入酶提取液1.5 mL，双氧水1.5 mL；标准组锥形瓶中依次加入磷酸缓冲液1.5 mL，双氧水1.5 mL。2组同时保温一段时间后各加入1.5 mL的硫酸，分别用高锰酸钾滴定法，记录各试验组出现颜色变化的时间。

式中，A为标准组高锰酸钾滴定量；B为试验组高锰酸钾滴定量；VT为提取CAT酶液的总体积（3 mL）；VS为反应中CAT酶提取液的用量（1.5 mL）；W为谷子茎叶鲜质量（0.2 g）；t为试验组反应的时间。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析与研究，对试验数据进行单因素方差分析；采用Tukey法进行多重比较（P＜0.05和P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 不同品种之间谷子保护酶（SOD、POD和CAT）活性的比较

在清水处理中，张杂谷5号的POD和SOD保护酶活性显著高于其他3种谷子，晋谷21号的CAT保护酶活性显著高于其他3种谷子（P＜0.01）（表1）。

通过方差分析得到不同品种之间谷子的3种保护酶活性都存在极显著差异（P＜0.01）,多重比较结果显示（表1），在5%显著水平上，张杂谷13号和晋谷59号的CAT保护酶活性不存在显著性差异，但张杂谷5号的CAT保护酶活性同晋谷21号相比较，存在显著的差异（P＜0.05）；张杂谷13号的SOD保护酶活性同晋谷21号相比较，无显著性差异，但张杂谷5号的SOD保护酶活性同晋谷59号相比较，存在显著性差异（P＜0.05）；4种谷子的POD保护酶活性都存在显著差异（P＜0.05），并且POD保护酶活性由高到低的顺序为张杂谷5号＞晋谷21号＞张杂谷13号＞晋谷59号。4种谷子的SOD保护酶活性由高到低的顺序为张杂谷5号＞晋谷21号＞张杂谷13号＞晋谷59号。4种谷子的CAT保护酶活性由高到低顺序为晋谷21号>张杂谷5号>晋谷59号>张杂谷13号。

表1 不同品种之间3种保护酶活性Tukey法多重比较结果Tab.1 Multiple comparison results of activities of three protective enzymes between different foxtail millet varieties by Tukey method

2.2 不同烯禾啶浓度下谷子保护酶（SOD、POD和CAT）活性的比较

4种谷子的POD和SOD保护酶活性的平均值随着烯禾啶浓度的升高逐渐增强，CAT酶活性随着烯禾啶浓度的升高先增强后降低（表2）。

通过方差分析可以得出，不同烯禾啶浓度下谷子的3种保护酶活性都存在极显著差异（P＜0.01）。由表2可知，在5%显著水平上，4种除草剂浓度下3种保护酶活性均存在显著性差异（P＜0.05）。其中，POD保护酶活性和SOD保护酶活性在5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油浓度下显著高于其他浓度（P＜0.05）；CAT保护酶活性在1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油浓度下显著高于其他浓度（P＜0.05）；谷子3种保护酶活性在清水对照下显著低于施用除草剂的各处理（P＜0.05）。综上可以得出，5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油浓度下POD和SOD酶活性最佳；1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油浓度下CAT酶活性最佳；清水对照下，3种保护酶活性均最低。

表2 不同烯禾啶浓度下3种保护酶活性Tukey法多重比较结果Tab.2 Multiple comparison results of activities of three protective enzyme under different concentrations of sethoxydim by Tukey method

2.3 不同烯禾啶浓度下不同品种之间谷子保护酶（SOD、POD和CAT）活性的比较

不同烯禾啶浓度下不同谷子品种之间3种保护酶活性存在显著差异（P＜0.05），张杂谷5号的POD和SOD保护酶活性在12.5%烯禾啶乳油5 mL/L浓度下最高；晋谷21号CAT酶活性在除草剂1.25 mL/L浓度下最高；4种谷子3种保护酶活性在清水对照处理均最低（表3）。

表3 不同烯禾啶浓度下不同品种之间谷子3种保护酶活性多重比较结果Tab.3 Multiple comparison of activities of three protective enzymes in foxtail millet under different concentrations of sethoxydim

进行多重比较分析得出（表3），在5%显著水平上，不同烯禾啶浓度下不同品种之间谷子3种保护酶活性都存在显著性差异。由表3可知，5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油处理张杂谷5号组合POD与SOD酶活性显著高于其他组合。晋谷59号清水处理的POD酶活性显著低于其他谷子品种（P＜0.05）；张杂谷13号清水处理的SOD酶活性显著低于其他谷子品种；1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油处理晋谷21号组合CAT酶活性显著高于其他组合，张杂谷13号清水处理的CAT酶活性显著低于其他品种（P＜0.05）。

通过表3具体分析，在4个浓度梯度下，每种谷子的POD和SOD保护酶活性都会随烯禾啶浓度的增加而增加，CAT保护酶活性都会随禾啶浓度的增加先增加后下降。当4个谷种都处于12.5%烯禾啶乳油5 mL/L浓度时，张杂谷5号的POD和SOD保护酶活性显著高于其他品种（P＜0.05）；12.5%烯禾啶乳油1.25 mL/L浓度时，晋谷21号的CAT保护酶活性显著高于其他品种（P＜0.05），且4种谷种在清水对照下3种保护酶活性均最低。

3 结论与讨论

除草剂作为外界干扰元素之一，会对谷子直接或间接产生破坏与威胁，此时SOD、POD和CAT作为保护酶系统之一，会相应作出保护与防卫。其中，SOD和POD保护酶都能够有效地清除谷子体内有害的自由基O2-，生成对谷子无害的氧气和毒害较低的过氧化氢；CAT保护酶对在SOD和POD保护酶作用下形成的过氧化氢进行催化与解离，最终使植物机能系统达到环境安全与动态平衡的水准。3种保护酶的存在不仅促进了谷子的良好发育，而且高效地提高了谷子的抗逆性，作用举足轻重。

据了解，对植物体内保护酶活性的试验研究较多。解丽丽[14]研究得出，随着除草剂12.5%烯禾啶乳油浓度的增加和处理时间的延长，张杂谷5号的POD和SOD保护酶活性不断提高，而晋谷21号随烯禾啶浓度的增加和处理时间的延长，谷子几乎接近死亡状态。但在早期处理的情况下，这2种谷种的CAT保护酶活性都出现了顶值现象，呈现倒U形的趋势。而且这2种谷子在除草剂为0 mL/L浓度下，3种保护酶的活性均最低。与本研究结果相似。杂交谷的抗逆性优于常规谷，这为杂交谷的广泛推广与大面积栽培奠定了坚实的基础。

张杂谷5号的POD与SOD酶活性随着烯禾啶浓度的升高而增强，且在最高的2倍浓度下活性最高，表明当谷子受到外界强烈胁迫与刺激时，POD与SOD酶能迅速对干扰作出攻击，高强度的解离系统内经胁迫产生的毒害自由基[19]，使系统处于平衡适应性状态，由此可见，杂交谷的育成可以显著提高抗性与耐性，为杂交谷的大力推广作出了事实依据。晋谷21号的CAT酶活性最佳，且在12.5%烯禾啶乳油1.25 mL/L浓度下活性极强。作为新推出的优质米，适宜除草剂浓度下，CAT酶发挥了应有尽有的防御功能，为常规谷的大面积种植，高产量培育，适度性抗逆提供了参考价值与实用意义。当谷子内部POD、SOD和CAT保护酶活性不高时，受外界胁迫的情况下就会积累大量有害的自由基，造成系统紊乱，以至于抗性降低，影响谷子的正常发育。在4个除草剂浓度梯度下，每种谷子的POD和SOD酶活性都会随浓度的增加而增加，CAT酶活性都会随浓度的增加先增加后下降，出现这样的原因可能是因为POD和SOD保护酶在极恶劣的胁迫下，发挥的防御作用越大越明显；而CAT保护酶自身受胁迫的影响，起始会出现最适宜的效果，随着胁迫的增强而作用降低。