侵染贵州火龙果的仙人掌X病毒基因组序列分离与变异分析

郑乾明， 柏自琴， 王小柯， 林 乾， 王 彬， 马玉华

(贵州省果树科学研究所， 贵州 贵阳550006)

0 引言

【研究意义】火龙果(Hylocereus.spp)是仙人掌科(Cactaceae)多年生草本攀援果树，目前主要在我国台湾、广西、广东、海南、云南、贵州和福建等地种植。在生产上火龙果普遍利用成熟茎进行无性繁殖，导致多种病毒大量积累，影响植株正常生长和开花结果[1]。分离侵染火龙果的病毒基因组序列，分析其遗传变异特点，有助于了解病毒传播规律和建立高效的分子检测体系，为苗木检疫、病毒早期检测和防控奠定基础。【前人研究进展】自2001年以来，火龙果受马铃薯X病毒属的仙人掌X病毒(CactusvirusX，CVX)[1-3]、蟹爪兰X病毒(ZygocactusvirusX，ZyVX)[3-4]和仙人指X病毒(SchlumbergeravirusX，SchVX)[3-5]侵染。近期报道花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)火龙果杆状DNA病毒1(Pitayabadnavirus1，PiBV1)也侵染贵州火龙果[6]。CVX最早在我国台湾省种植的疑似病毒感染火龙果植株中发现[1]，其基因组(GenBank登录号：AF308158)全长约6.6 kb，为单分体正义单链RNA病毒[2]。共编码5个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，分别为依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)、TGB1蛋白(Trige gene block 1)、TGB2、TGB 3和外壳蛋白(Coat protein，CP)。近年来，随着火龙果种植区域的快速扩大，在我国海南省[7-8]和贵州省[3,9]、韩国济州岛[10]、美国佛罗里达州[11]均有CVX侵染火龙果的相关报道。RT-PCR检测表明，海南省和贵州省火龙果的CVX检出率分别达86.7%和93.4%[8-9]。CVX-NTU(GenBank登录号：JF937699)是在我国台湾省首次报道的CVX的一个株系，其基因组序列与CVX一致性为78%。此前对贵州火龙果样品的宏转录组测序表明，CVX-NTU占病毒序列数量的85%，并拼接获得1条近基因组全长序列[3]。【研究切入点】CVX和CVX-NTU普遍侵染火龙果，目前报道的基因组全长序列较少，不能系统研究其遗传变异。【拟解决的关键问题】获得侵染火龙果的CVX和CVX-NTU基因组序列，分析其序列特征，了解病毒群体的遗传变异，为建立分子检测和防控体系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

感染病毒的火龙果样品采自贵州省安顺市镇宁县和黔南州罗甸县的火龙果种植园，品种为红肉火龙果“紫红龙”，采集期为盛果期。从茎表面表现褪绿、黄化等典型疑似病毒病症状的植株上采集样品，立即用冰盒带回实验室。样品擦净后自然晾干，去除茎表面的角质层，切成约3 mm薄片。锡箔纸包裹后液氮速冻，于-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 宏转录组测序 参照文献[3]的方法对样品进行总RNA提取、浓度和质量检测。参照文献[5]的方法进行文库构建和上机测序。测序获得的Raw read进行质控和过滤，产生的高质量Clean read利用Trinity v2.1.1软件组装成contig[12]。contig序列分别使用BLASTN和BLASTX程序在NCBI非冗余核酸和蛋白质数据库检索，设置E值<10-5。

1.2.2 序列分析 使用在线ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测病毒基因组中的ORF。在线的核苷酸和推导的氨基酸序列一致性计算使用NCBI网站的BLASTN程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，本地的核苷酸和推导的氨基酸序列一致性计算使用Lasergene软件(DNAStar公司)中的MegAlign程序。

1.2.3 系统进化分析 从 NCBI网站下载侵染火龙果的CVXs(AF308158和LC128411)和CVX-NTUs(JF937699和KX883791)基因组序列，以及侵染火龙果的ZyVX(AF366208)、SchVX(AY366207)和PiVX(JF930327)等序列，同时下载侵染仙人掌科的OpVX(AY366209)为外类群。使用Clustal W软件进行多序列比对，然后利用MEGA7.0软件构建基于邻位相接法的系统发育树，自展值检验进行1 000次重复。

2 结果与分析

2.1 病毒相关序列筛选

分析宏转录组测序数据中获得的contig序列，根据注释结果筛选CVX和CVX-NTU相关序列(表1)，获得CVX贵州火龙果分离物相关序列4条，长度为6 500～6 580 bp，分别命名为CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP，其基因组5′端缺失24～125个核苷酸，3′端缺失10～32个或增加5个核苷酸，覆盖参考基因组CVX(AF308158)全长的96.2%～99.5%。获得CVX-NTU贵州火龙果分离物相关序列5条，长度为6 563～6 603 bp，分别命名为CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP，其基因组5′端缺失24～33个核苷酸，在3′端最多缺失39个核苷酸，覆盖参考基因组CVX-NTU(JF937699)全长的99.0%～99.6%。

表1 宏转录组测序获得的CVX和CVX-NTU贵州火龙果分离物基因组序列

2.2 CVX基因组结构变异

从表2看出，以CVX(AF308158)为参考，贵州火龙果分离物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)及CVX-Jeju(LC128411)均出现若干一致的单碱基插入与缺失变异。在编码RdRP的ORF中，第4 349个和4 635个核苷酸处分别插入1个碱基，第4 359个、4 541个、4 574个、4 589个和4 656个核苷酸处分别缺失1个碱基。在编码CP的ORF中，第6 133个、6 147个和6 163个核苷酸处分别插入1个碱基。

表2 CVX贵州火龙果分离物与参考基因组CVX(AF308158)的序列变异

2.3 CVX、CVX-NTU贵州火龙果分离物的序列差异

2.3.1 CVX序列差异 4条CVX贵州火龙果分离物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)之间基因组序列一致性为98.3%～98.6%，与CVX(AF308158)一致性为97.5%～98.0%，与CVX-Jeju(LC128411)一致性为97.1%～97.4%(表3)，与NCBI中仅有部分序列的CVX分离物一致性为96.5%～99.4%。

CVX贵州火龙果分离物RdRP编码的氨基酸序列之间一致性为98.6%～99.3%，高于其与CVX(AF308158)和CVX-Jeju的一致性(表4)。贵州分离物TGB1编码的氨基酸序列之间一致性为99.1%～99.6%，高于与CVX-Jeju的一致性，低于与CVX(AF308158)的一致性。贵州分离物TGB2编码的氨基酸序列之间一致性为96.4%～98.2%，基本等同于其与CVX(AF308158)和CVX-Jeju的序列一致性。贵州分离物TGB3编码的氨基酸序列之间一致性为98.4%～100%，略高于其与CVX(AF308158)和CVX-Jeju的一致性。贵州分离物CP氨基酸序列之间一致性为98.2%～100%，明显高于其与CVX(AF308158)的一致性。

2.3.2 CVX-NTU序列差异 5条CVX-NTU贵州火龙果分离物(CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP)之间基因组序列一致性为98.1%～98.8%，与CVX-NTU(JF937699)一致性为97.7%～97.9%，与SCM51431(KX883791)的一致性为97.6%～99.1%，与CVX-NTU-GZ分离物的一致性97.9%～98.1%(表3)，与NCBI中仅有部分序列的CVX-NTU分离物的序列一致性为94.9%～99.1%。

表3 CVX和CVX-NTU贵州火龙果分离物与其他分离物的基因组序列一致性

从表4看出，CVX-NTU贵州火龙果分离物RdRP氨基酸序列之间一致性为98.8%～99.6%，略高于与CVX-NTU(JF937699)的一致性。贵州分离物TGB1氨基酸序列之间一致性为99.1%～100%，基本等同于其与CVX-NTU(JF937699)、SCM51431和CVX-NTU-GZ的一致性。贵州分离物TGB2氨基酸序列之间一致性为99.1%～100%，略高于其与CVX-NTU(JF937699)和CVX-NTU-GZ的序列一致性。贵州分离物TGB3氨基酸序列之间一致性为100%，高于其与CVX-NTU-GZ的序列一致性。贵州分离物CP氨基酸序列之间一致性为99.6%～100%，均高于其与CVX-NTU(JF937699)、SCM51431和CVX-NTU-GZ的序列一致性。

表4 CVX和CVX-NTU贵州火龙果分离物与其他分离物ORF编码的氨基酸序列一致性

2.4 系统进化

将CVXs和CVX-NTUs及侵染火龙果的马铃薯X病毒属病毒ZyVX、SchVX和PiVX共同构建系统进化树。基于基因组序列的系统进化分析表明(图1)，CVXs和CVX-NTUs分别位于不同的类群，与ZyVX、SchVX、PiVX和OpVX明显分开。4个CVX贵州火龙果分离物聚为一类，未发生明显遗传分化。CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-GZ聚为一类，CVX-NTU-LW、CVX-NTU-ZYP和SCM51431聚为一类，未表现出明显的遗传分化规律。

图1 CVX和CVX-NTU贵州火龙果分离物基于基因组序列的系统进化树

3 讨论

目前在NCBI提交的CVX和CVX-NTU株系序列共27条，其中5条为基因组全长序列，大部分仅为基因组序列片段。宏基因组或宏转录组随着高通量测序技术发展而来，广泛用于鉴定病毒种类、获得基因组全长、分析病毒群体结构和遗传多样性[13]。对多年生园艺作物采用富集病毒小RNA[14-15]，去寄主核糖体RNA[16-17]，或富集病毒双链RNA[18-19]等策略，成功分离并获得多种病毒的基因组序列。本研究采用去寄主核糖体RNA构建测序文库，共获得CVX和CVX-NTU株系相关的9条近全长基因组序列，极大扩充了目前CVX群体的基因组数据库。

4条CVX贵州火龙果分离物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)近全长基因组序列与NCBI中参考序列CVX(AF308158)相比，出现10处单碱基的插入或缺失，进而导致出现移码突变，改变多个氨基酸的种类和序列。综合分析推测，本研究获得的CVX贵州分离物与参考序列CVX相比，其出现上述变异的可能性不大，而是由于参考序列CVX测序出错导致。首先，参考序列CVX基因组经分段RT-PCR扩增，然后对若干克隆测序获得，其测序克隆数量一般较少，准确率略低[2]。其次，本研究采用的Illumina测序具有高深度和高准确率的特点[13]，4条CVX贵州分离物序列在上述10处位点完全一致，同时CVX-Jeju分离物序列在上述位点也与CVX贵州分离物完全一致。并且，目前侵染火龙果的马铃薯X病毒属其他病毒[3-5]，均未出现如此大范围的碱基插入或缺失等造成的移码突变。因此，未来有必要重新明确高质量的CVX基因组全长序列作为参考基因组。

CVX贵州火龙果分离物与CVX(AF308158)和CVX-Jeju构成的CVX群体基因组序列一致性为97.1%～98.6%，略高于包括SchVX贵州火龙果分离物在内的病毒群体[5]，显著高于包括ZyVX贵州火龙果分离物在内的病毒群体[20]。CVX贵州分离物之间的RdRP、TGB1、TGB3和CP编码的氨基酸序列一致性较高，仅TGB2编码的氨基酸序列一致性略低。比较CVX贵州分离物与CVX-Jeju分离物的ORF编码氨基酸序列，其序列一致性水平接近于CVX贵州分离物之间。比较CVX贵州分离物与CVX(AF308158)的RdRP和CP编码氨基酸序列，其序列一致性水平均低于CVX贵州分离物之间。较低的序列一致性主要源于碱基插入或缺失造成的移码突变，但根据上述推测可知其并不存在。系统进化分析也表明，4个CVX贵州分离物聚为一类，与CVX(AF308158)和CVX-Jeju未呈现明显遗传分化规律。因此，当前CVX群体的遗传变异均为单核苷酸变异，其基因组和ORF编码的氨基酸序列变异较小，未发生明显遗传分化。

CVX-NTU贵州火龙果分离物与其他3个具有基因组全长的分离物共同构成CVX-NTU群体，其基因组序列一致性为97.6%～99.1%。CVX-NTU贵州分离物之间基因组序列一致性为98.1%～98.8%，略高于此前报道的包括CVX-NTU-GZ在内的病毒群体[3]，明显高于包括ZyVX贵州火龙果分离物在内的病毒群体[20]。氨基酸序列一致性表明，CVX-NTU贵州分离物5个ORF编码的氨基酸序列一致性较高，与其他3个分离物的序列一致性水平基本一致。结合系统进化分析，共同说明目前CVX-NTU群体的遗传变异较小，未表现明显的遗传分化规律。

4 结论

研究获得4条CVX(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)和5条CVX-NTU(CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP)贵州火龙果分离物近全长基因组序列，长度为6 494～6 603 bp，覆盖参考基因组96.2%～99.6%。CVX贵州分离物之间的基因组序列一致性为98.3%～98.6%，与已报道的其他分离物基因组序列一致性为97.1%～98.0%。CVX-NTU贵州分离物之间的基因组序列一致性为98.1%～98.8%，与已报道的其他分离物基因组序列一致性为97.6%～99.1%。系统进化分析表明，CVX和CVX-NTU群体未出现明显的遗传分化。

研究基于宏转录组测序获得CVX及其CVX-NTU株系的9条贵州火龙果分离物近全长基因组序列，显著扩大了当前CVX群体的基因组序列数量。目前CVX及CVX-NTU株系群体基因组的遗传变异较小，尚未发生明显的遗传分化。上述特点有助于快速建立病毒的分子检测体系，为苗木检疫、病毒早期检测和防控奠定理论基础。