贵州锌硒茶茶多糖的超声辅助提取工艺优化

李密转， 李名立， 陈宏燕， 杨邦海， 李秋萍， 许 洁

(遵义医科大学 公共卫生学院， 贵州 遵义 563003)

0 引言

【研究意义】凤冈锌硒茶是贵州省三大名茶之一，是中国国家地理标志产品[1]。茶多糖(Tea Polysaccharides，TPS)是绿茶中一种具有生理活性的酸性复合蛋白，又称茶活性多糖[2-3]。茶多糖及微量元素结合多糖具有降血糖、防治糖尿病、抗氧化和保肝性、调节免疫力与抗肿瘤、防辐射、保护造血功能、降血压和抑菌等功能[4-6]。因此，深入研究贵州凤冈锌硒茶茶多糖的提取，对开发贵州绿茶资源具有重要意义。【前人研究进展】目前，用于辅助提取茶多糖的方法主要有水浸法、加酶法、微波法、超声法等[7]，其中水浸法提取效率低，获得的茶多糖杂质多，易受温度影响；酶法利用纤维素酶、蛋白酶等破坏植物细胞，提高多糖提取率，但酶法设备要求高，实验条件要求严格，提取茶多糖成本高，不利于扩大生产；微波辅助法能利用瞬时穿透式加热提高茶多糖提取率，可节省时间和节约能源，但微波提取极难保持恒温，且存在微波的高能电磁波泄露等问题[8]。运用超声辅助提取茶多糖，利用超声的空化效应和机械作用对植物的细胞壁加以破坏，细胞膜的结构残损，细胞内容物得到更快释放。此方法不易使茶多糖的化学性质被破坏，且能提高茶多糖的提取率，能耗小、提取时间短、提取得率高、使用溶剂少[9]。【研究切入点】目前，对于贵州凤冈锌硒茶茶多糖多采用水提等传统方法，提取时间长，能耗较大，提取率低[10]。且贵州锌硒茶中多糖运用超声辅助提取的研究未见详实报道。【拟解决的关键问题】采用超声辅助提取贵州凤冈锌硒茶的茶多糖，利用响应面法优化提取茶多糖的提取工艺，提高效率、节约能耗，为贵州锌硒茶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 贵州凤冈锌硒茶购自贵州省凤冈县万壶缘茶业有限公司；D-无水葡萄糖和L-阿拉伯糖购自安徽合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 试剂 浓硫酸、丙酮和无水乙醚购自成都市科龙化工试剂厂；无水乙醇、5%苯酚水溶液购自北京绿泽森生物技术有限公司贵州分公司：水为自制蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备 BL13-300H型超声清洗仪购自海比朗仪器有限公司；DGX-8243B型高温鼓风干燥箱购自海百典仪器设备有限公司；B-220型恒温水浴锅购自亚荣生化仪器厂；RE52CS型旋转蒸发仪购自海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵购自广州长城工贸有限公司；cence湘仪L500型台式低速离心机购自广州沪瑞明仪器有限公司；759型紫外可见分光光度计购自上海菁华有限公司；FA2004N型分析天平购自上海海菁海仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 凤冈锌硒茶粉碎→过40目筛→超声(2次)辅助提取(单因素试验)→过滤除渣→旋转蒸发(80℃，蒸发至原体积1/4)→醇沉→离心(3 000 r/min，15 min)→洗涤沉淀→干燥→茶多糖。

1.2.2 标准品溶液制备 10 mg/mL葡萄糖供试液：取D+-葡萄糖对照品0.010 0 g加蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至100 mL。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

1) 全波长扫描。设置扫描波长为200～800 nm，选择ABS扫描模式，设置1 nm为扫描间距，以空白样做扫描基线，扫描待测样品溶液的吸光值。

2) 葡萄糖溶液扫描。分别用移液管移取葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于已编号试管中，用移液管移取蒸馏水稀释葡萄糖溶液至2.0 mL，在室温下向试管中加入1.0 mL的5%苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸，振荡摇匀。将水浴锅温度设置为40℃，将试管放入水浴锅中水浴30 min取出，室温放置10 min。以0 mL葡萄糖溶液为空白对照组。在全波长扫描的结果波长处测定其吸光度。标准曲线纵坐标为吸光度，横坐标为葡萄糖质量浓度[11]。

1.2.4 换算因子的测定 用分析天平精确称取20 mg已干燥至恒重的茶多糖至烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，将烧杯中溶液移入100 mL容量瓶定容，质量浓度为0.20 mg/mL。用移液管移取1 mL该水溶液于试管加水稀释至2 mL，后续步骤按照1.2.3中2)方法测定该水溶液中茶多糖吸光值。按照所得的葡萄糖回归方程计算提取液中葡萄糖含量C，换算因子按公式(1)计算。

f=m/(C×D)

(1)[11]

式中，m为称取的多糖质量(mg)，C为称取多糖中葡萄糖的含量(mg)，D为茶多糖稀释倍数(此处为2×100)。

1.2.5 提取液中茶多糖含量测定 移取0.1 mL茶多糖提取液于已编号的试管，加水至2 mL，后续步骤按照1.2.3方法测定提取液中茶多糖吸光值。计算凤冈锌硒茶中茶多糖提取率[11]。

茶多糖提取率=CD×f/m×100%

(2)[11]

式中，C为茶叶多糖中葡萄糖的含量(mg)，D为多糖的稀释倍数，f为换算因子，m为称取的茶叶粉质量(mg)。

1.2.6 单因素试验 按照超声时间(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)、超声功率(120 W、150 W、180 W、210 W、240 W)、超声温度(65℃、70℃、75℃、80℃、85℃)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30)分别进行单因素试验。

1.2.7 响应面优化试验 利用Design-expert 8.0.6中Box-Behnken法，根据单因素试验结果，固定茶水溶剂比1︰25，确定超声温度(A)、超声时间(B)和超声功率(C) 3个因素(表1)，以提取液中茶多糖得率为响应值，进行3因素3水平试验，对超声辅助提取锌硒茶中茶多糖的提取工艺加以优化。

表1 响应面分析因素及水平

1.3 数据处理

利用Design-expert 8.0.6分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线与换算因子的计算

2.1.1 全波长扫描 在紫外吸收波长200～800 nm，葡萄糖溶液的最大吸光值于490 nm处出现。

2.1.2 葡萄糖标准曲线 如图1所示，回归方程为y= 14.707x+ 0.007 8，R2= 0.995 7，线性关系良好。单因素试验中，选择490 nm吸光值。

图1 葡萄糖标准曲线

2.1.3 换算因子 根据公式(1)计算得到f=3.87。

2.2 不同处理的提取率

由图2可知，在一定范围内，提取率着超声功率的增加而提高，超声功率为150 W时，提取率最高，之后增大超声功率，提取率降低。超声时间和超声温度为45 min和70℃时提取率最高，之后随着时间和温度的增加，提取率反而降低。料液比在1︰(20～25)时，提取较高。因此，贵州锌硒茶茶多糖提取的最佳超声提取功率为150 W、超声时间为45 min、超声温度为70℃、料液比为1︰25。

图2 不同超声功率、超声时间、超声温度和料液比的提取率

2.3 响应面优化

2.3.1 回归方程 由表2和表3可见，利用设定17个点计算不同条件下锌硒茶中茶多糖的提取率，分析得到茶多糖提取率的回归方程为Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。

由表2可知，该回归方程显著(F=4.04，P<0.05)；相关系数R2=0.840 8，说明有超过84%的真实值可以用该模型来反映。失拟项不显著(F=0.85，P>0.05)，说明该模型能较好反映实际试验情况。由表2中各参数的P值可知，超声功率(C)对提取得率有显著影响，超声温度(A)和超声时间(B)对提取率无明显影响。AB的交互作用对提取率影响显著，AC、BC的交互作用对提取率无显著影响。因素C显著影响提取率，而其他2个因素的二次方对结果无显著影响。3个因素对提取率的影响程度为C>B>A，A、B、C两两间的交互作用对提取率影响程度为AB>BC>AC。

表2 响应面试验设计回归方程参数值

表3 响应面试验下茶多糖的提取率

2.3.2 响应面与等高线 由图3可知，AB之间的交互作用显著影响提取率，AC、BC两两间的交互作用对提取率无显著影响。

图3 AB、AC、BC交互作用下茶多糖的提取率

2.3.3 验证 因图4与图5残差曲线沿直线近似，因此满足正态性假设。图5中残差与方程预测值的对应图，残差表现出随机散射，表明原始观察的方差对于所有值都是恒定的。图4和图5比较符合模型。因此，预测模型可以描述响应面的提取率。

图4 残差的正态概率

图5 残差与预测响应的关系

响应面分析获得的最优提取条件：超声温度71.68℃、超声时间37.73 min、超声功率139.05 W。在此条件下预测锌硒茶茶多糖提取率最大值为7.42%。为检验该方法的可靠性，结合实际操作的便利性，将工艺修正为超声温度70℃、超声时间40 min、超声功率150 W。对修正后工艺进行3次试验，得到锌硒茶茶多糖的实际平均提取率为7.05%，与优化的预测值(7.42%)相对误差为0.37%。

2.4 超声辅助工艺与未超声工艺茶多糖提取率的比较

选择响应面优化的超声辅助工艺条件：温度70℃、时间40 min、功率150 W，选择料液比为1︰25，进行锌硒茶中茶多糖的提取试验，选择不经超声处理的茶叶样品为空白组，超声处理的茶多糖提取率(7.58%)明显高于不经超声处理的茶多糖提取率(5.42%)。经超声处理后，茶多糖的提取率可提高42.50%。

3 讨论

茶多糖类化合物的提取若采用超临界流体技术等新兴技术，虽提取效果较好，但其成本高昂，对设备要求高，不利于工业化提取。选择微波、超声波等方法提取可以很好地克服以上缺点，在绿色环保的基础上保证较高的茶多糖提取率。荆晶等[10]采用水提醇沉法提取贵州绿茶中茶多糖，其3个不同产地的绿茶中茶多糖得率为4.73%～5.75%。该研究不采用超声提取的茶多糖得率为5.42%，与荆晶等[10]的研究结果相当。响应面和等高线图是考察因素之间两两交互作用的关系及显著性[9,12]。该研究利用单因素和响应面优化两者结合的试验方法，采用超声辅助水提法提取贵州锌硒茶中的茶多糖，其茶多糖的提取率可以达到7.58%，明显高于不经超声处理的茶多糖得率(5.42%)，与陈义勇等[13]的研究结果基本一致，其传统水溶提取法茶多糖的提取率明显低于超声-微波提取法；但与缑鸿达等[14]的研究结果相悖，可能与提取温度有关。缑鸿达等[14]在水提时水温为80℃，超声处理时仅为55℃，热水提取效果好于超声效果。

浸提条件对茶多糖提取率的影响有直接关系，超声波提取法主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大有效成分溶出[15]。陈仕学等[16]采用超声波法提取石阡苔茶中的茶多糖，比常规提取法所得茶多糖含量高出55%。黄永春等[17]比较了传统水提法和超声提取粗老绿茶多糖的差异，与传统的水提法相比，提取率由4.21%提至5.15%。而在该研究中，超声辅助提取锌硒茶多糖所得的提取率，与传统水提法提取锌硒茶茶多糖相比，提取率由5.42%提至7.58%，与陈仕学等[16-17]的研究结论基本一致。表明，超声波法在茶多糖的提取方面具有操作方便、高效、绿色环保等特点。

4 结论

以贵州凤冈锌硒茶为原料，利用单因素和响应面Box-Behnken分析法对影响贵州锌硒茶茶多糖提取率的工艺条件进行优化，建立的回归方程：Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。超声辅助提取锌硒茶的最佳工艺：超声温度(A)70℃、超声时间(B)40 min、超声功率(C)150 W、料液最佳配比1︰25。在该条件下，超声处理茶多糖的提取率可达7.58%，比未经超声处理的空白组提取率提高42.50%。采用该辅助工艺可为锌硒茶茶多糖的提取、分离和纯化以及锌硒茶的开发利用奠定基础。