响应曲面法优化西藏黑青稞中多酚提取工艺

次仁德吉

（西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，西藏 拉萨 850032）

青稞是一种能够适应高原极端气候的粮食作物，其生长史可追溯久远。作为一种具有强烈地域特色的高原麦类作物，青稞的营养价值相较于其他谷物较大，具有高蛋白、高纤维、低脂肪、低糖的特征，这符合当代人们的健康饮食结构。随着人们对膳食中多酚含量的重视，富含多酚物质的产品在市场上得到较多推广。麦类作物因含丰富的多酚（也称植物单宁），被认为是具有促进健康的潜在功能谷物。植物多酚在植物体内广泛存在，比如植物的皮、叶、根、果中。多酚物质是植物体内复杂的次生代谢产物，属于天然有机化合物，作为一类储量丰富的可再生绿色资源，能够提高果蔬类及其他可食用植物的感官品质和营养品质。目前，已发现的植物酚类化合物超过8 000 种，大多数分布于水果和药用植物中，如茶叶、金银花、葡萄等，此外还分布于青稞、燕麦、小米等谷类作物中。这些酚类物质有多种不同的分类方法，在植物中多酚类化合物可分为简单酚、黄酮类、木脂素类、酚酸类衍生物和香豆素类等。研究发现，多酚类物质可以清除体内自由基的酚羟基，这类物质可阻止体内细胞氧化损伤；营养学研究表明，多酚在抗癌、降血糖、降血脂、防止心血管疾病及抗菌等生物活性、药理学领域发挥着巨大的药理作用。

由于青藏高原地大面广，不同地域因独特的地理环境，所培育出的青稞品种也较不同，大致以白色青稞、紫色青稞、黑色青稞及蓝色青稞4 个种类来区分，其中黑青稞较其他种类的青稞富含多酚、花青素等活性物质，具备了较为独特的食用功效。Gong 等研究发现，相较于白色青稞，有色青稞中的多酚含量相对较高。夏陈等在对不同品种青稞总多酚含量的比较中发现，除98029 黑青稞外，产于同一地域的青稞中深色青稞的多酚含量远高于浅色青稞，但对于黑青稞中多酚提取工艺的优化等方面的研究较少。研究表明，多酚提取条件的不同，对于多酚含量多少存在影响。因此本研究在比较5 种藏区主推青稞品种籽粒中的多酚含量后，最终确定以含量相对较高的黑青稞为研究对象，采用响应曲面法，探索最佳提取条件，旨在优化青稞多酚提取工艺，为黑青稞实际应用及产品开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

黑青稞与紫青稞，均购自西藏山南隆子县；藏青25，取自西藏自治区农牧科学院4 号实验地；喜拉22，购自日喀则白朗县；藏青2000，取自西藏自治区农牧科学院4 号实验地。

试剂（优级纯）：95%乙醇、没食子酸、福林酚、无水碳酸钠，均购自于成都科隆化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

TV-1901 紫外可见分光光度计，购自于上海美普达仪器有限公司；3-18KS 离心机，购自于德国SIGMA 公司；CFB 数显恒温水浴锅，购自于郑州长城科工贸有限公司；BS224S-CW 电子天平，购自于德国Sartorius 公司；THZ 电热鼓风恒温干燥箱，购自于常州普天仪器制造厂。

1.3 试验方法

1.3.1 绘制标准曲线。上机测定标准溶液，测得曲线在检出范围内呈现出良好的线性关系，线性方程为＝0.098 35+0.016 17，式中：X 表示样品吸光度；表示测得样品质量浓度；决定系数为0.999 4。结果见表1。

表1 标准曲线配制及相关内容

1.3.2 多酚含量的测定。选取藏青2000、藏青25、紫青稞、喜拉22、黑青稞，筛选出颗粒较为饱满的青稞籽粒，将样品置于60 ℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎过50 目筛，干燥密封，保存待测。每个品种称取1 g，测3 次平行。在一定的条件下，加入一定比例的粉末样品和乙醇溶剂，水浴冷却，将提取到的样液于转速7 000 r/min 下离心5 min，将分层的清液取出，置于棕色瓶内，存至冰箱冷藏，以备待测。参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，以蒸馏水作空白对照，上机在波长765 nm处测定样品提取液中多酚的质量浓度（μg/mL）。

式中：为样品中多酚的含量，mg/g；为待测溶液质量浓度，μg/mL；为提取液总体积，mL；为稀释因子；为样品质量，g。

1.3.3 提取工艺的优化。以山南隆子黑青稞为试验对象，准确称取1.00 g 青稞粉，以提取时间（30、70、110、150、190 min）、料液比（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取温度（30、40、50、60、70℃）、乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80%）为自变量，验证4 种变量值对黑青稞多酚提取量的影响，每个水平测3 次平行。

响应面优化试验设计。为获得最佳的工艺条件，本次试验以优化黑青稞中多酚含量的提取工艺为目的，以Box-Behnken 试验原理，设计提取时间、料液比、提取温度、乙醇体积分数为自变量，多酚提取量作为因变量（响应值），开展试验，响应面因素水平见表2。

表2 Box-Benhnken 设计试验因素水平及编码

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间的选择。根据提取时间引起多酚含量变化的趋势图（图1）可知，在时间达到70 min 时多酚提取量达最大峰值，此后多酚的提取量逐渐降低，趋于平缓。随着提取时间的推移，黑青稞中多酚的含量先增后减，原因可能是在提取过程中，黑青稞中的多酚物质在空气中分解，使其在达到一定的峰值后提取量呈缓慢下降趋势。故设定提取时间为70 min 最佳。

图1 提取时间对多酚提取量的影响

2.1.2 料液比的选择。根据提取料液比引起多酚含量变化的趋势图（图2）可知，黑青稞中的多酚提取量在料液比（g∶mL）1∶10 至1∶20 的区间内有较为明显的变化。随着溶剂用量的逐步增大，料液比在1∶20 时提取量达到最高。溶剂用量的选择对黑青稞多酚提取量存在影响，料液比（g∶mL）超过1∶20 时，黑青稞中多酚提取量呈缓慢下降趋势。其原因在于黑青稞中多酚物质在乙醇溶剂中的溶解度是一定的，料液比会影响溶液的黏度和浓度。当料液比较小时，溶液黏度大，多酚物质不易扩散，提取率小；当其逐渐升高时，由于有浓度差，因此扩散快，提取率变高；当温度升高到一定时，因浓度差变小，提取率趋于平衡。故选择1∶20 为最适宜的料液比（g∶mL），以为后期节约成本。

图2 料液比对多酚提取量的影响

2.1.3 提取温度的选择。根据提取温度引起多酚含量变化的趋势图（图3）可知，随着温度的升高，黑青稞中多酚的提取量也随之提高，当提取温度达50℃时，黑青稞多酚提取量高于其余4 个设定的温度，这可能是温度的变化导致黑青稞中多酚物质分子间动能变大，使分子距离也变大，多酚物质得到降解或挥发。为节约工艺成本，故选择提取最佳温度为50 ℃。

图3 提取温度对多酚提取量的影响

2.1.4 乙醇体积分数的选择。根据乙醇体积分数引起多酚含量变化的趋势图（图4）可知，多酚的提取量随乙醇体积分数的变化，呈现先增高后降低的趋势，当乙醇体积分数达到50%时，黑青稞中多酚的提取量达到最大，而后随着乙醇体积分数的增加，提取量反而呈现减少趋势。这可能与高浓度溶质的水解产物对多酚物质进一步水解抑制的能力强于低浓度溶剂有关，故浸提的乙醇体积分数应选50%为宜。

图4 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

2.2 响应曲面法分析优化黑青稞多酚提取工艺

2.2.1 Box-Benhnken 试验设计。参考得到的单因素预试验结果，设计响应面时零水平因素分别为提取时间70 min、料液比（g∶mL）1∶20、提取温度50 ℃和乙醇体积分数50%，以黑青稞多酚物质的提取量为响应值，设计BBD 四因素三水平试验。

2.2.2 试验模型的建立。运用Design-Expert 8.06 对所得试验结果进行多元回归拟合，获得黑青稞多酚物质得率（）与4 个因素的多元回归方程：=-11.732 76+0.043 782A+0.732 9B+0.180 88C+0.043833D- 2.5×10AB- 4.125×10AC- 1.5×10AD+2.05×10BC - 1.15×10BD + 1.075×10CD -8.921 87 A- 0.017 9B- 2.527 5×10C- 6.025×10D。试验分析结果见表3。

表3 Box-Benhnken 设计表及试验结果

2.2.3 数据模型方差分析。根据表4 的方差分析结果，模型中响应变量与回归变量得到的方程分析结果显著（＜0.000 1）。模型（＜0.05）失拟不显著，说明本次试验的二次模型拟合程度良好；决定系数（）为0.965 4，变异系数（）为1.56%，信噪比为19.162，说明该方程拟合程度很高，数据合乎真实的试验结果，可将其用于本次试验工艺优化条件的预测分析。结合表4 检验各个回归系数显著性，比较值可得到影响因素的程度大小，依次为料液比＞时间＞温度＞乙醇体积分数（B＞A＞C＞D）。由图5—7 可知，AC（提取时间和温度）、BC（料液比和提取温度）、CD（提取温度和乙醇体积分数）两两不同条件间交互作用显著。

图5 提取温度和时间对多酚提取量的影响

表4 方差分析表

2.2.4 响应面优化三维图分析。分析各提取条件交互作用下黑青稞多酚提取量的响应面及等高线图可知，分别有3 组提取条件（AC、BC、CD）两两交互作用显著，响应曲面陡峭且等高线趋于椭圆状；比较分析图8—10，发现交互作用不明显。以黑青稞中多酚提取量较大为目标，拟合方程求解得到的4 个因素最佳提取条件为：提取时间70 min，料液比（g∶mL）1∶21.15，提取温度49.66 ℃，乙醇体积分数51.79%。在此条件下，青稞多酚提取量最高可达到3.098 mg/g。为方便试验操作，将预测值修正至提取时间70 min，料液比（g∶mL）1∶20，提取温度50℃，乙醇体积分数60%。平行试验3 次，得到提取量的平均值为3.03 mg/g，与模型预测出的值较为接近，说明该模型拟合程度基本符合预估值，采用响应曲面法分析得到的4 个最佳条件准确可靠。

图8 提取时间和料液比对多酚提取量的影响

图6 提取温度和料液比对多酚提取量的影响

图7 提取温度和乙醇体积分数对多酚提取量的影响

图9 提取时间和乙醇体积分数对多酚提取量的影响

图10 料液比和乙醇体积分数对多酚提取量的影响

2.2.5 5 个青稞品种中多酚含量的差异。由表5 可知，5 个品种青稞的多酚含量变异幅度在1.65～2.96 mg/g，黑青稞及紫青稞中多酚含量较高，这可能与籽粒麸皮的颜色有关，这一推测与张帅等的研究结论一致；青稞中总多酚的含量存在差异，也可能与青稞的栽种地域环境的不同有关。

表5 5 个品种青稞多酚含量差异

3 讨论与结论

比较藏区主推品种青稞中多酚含量的差异，可以发现，黑青稞中多酚的含量高于紫青稞、藏青25、喜拉22、藏青200。该结论可为优化黑青稞中多酚物质功能成分的研究提供依据。

以西藏隆子黑青稞为试验原料，优化黑青稞多酚物质的提取工艺，分析得出的最优提取条件为：提取时间70 min，料液比（g∶mL）1∶20，提取温度50 ℃，乙醇体积分数60%，得到提取量的均值为3.03 mg/g。

确定单因素试验对优化结果影响的大小顺序：料液比（B）＞时间（A）＞温度（C）＞乙醇体积分数（D），料液比对于优化结果影响最大，乙醇体积分数对于优化结果影响最小，该结论与李京城等对隆子黑青稞花色素提取研究中单因素（乙醇体积分数）对于优化结果影响最小的结论一致，其余因素或因提取物质的不同，影响程度不一致，该原因需后期进一步深入研究。