MicroRNAs在糖尿病视网膜病变中的相关研究进展

黎晓冬，武海燕，何润西，谢学军，徐铭超

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病眼部的主要慢性致盲并发症，当前已成为我国重要的公共卫生安全问题。随着研究的深入，DR不仅是单纯的进展性微血管病变，而且是一种视网膜神经血管单元(神经元、胶质细胞、血管内皮细胞及周细胞等)受损的多组织病变，以视网膜血管通透性增加、新生血管生成和神经退行性改变为主要特征，目前临床应用治疗DR的靶点主要是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，对视网膜微血管内皮细胞和周细胞信号转导以及炎性细胞因子等新疗法也在探索中[1]。临床常用的视网膜激光光凝及抗VEGF等治疗方式都有一定的局限性，且复发率高，因此从基因水平深入探究发病机制有利于进一步提高DR的防治水平。MicroRNAs(miRNAs)调控着人类大部分基因，参与人体各种疾病的发生发展。近年来基于miRNAs靶基因和信号通路的研究表明miRNAs在DR发病机制中发挥着关键的调控功能[2]，故本文将对miRNAs及其参与DR的发病机制和治疗前景等相关研究予以综述。

1 miRNAs概述

miRNAs是一类由22～25个核苷酸组成的小分子单链非编码RNA，第一个miRNA是1993年在秀丽隐杆线虫中被首次发现的，是由lin-4基因产生的一种短RNA，其在转录后抑制lin-14 mRNA[3]，即miRNAs通常在转录后调节基因表达，可下调或抑制靶向转录本的蛋白质水平。目前研究发现miRNAs并非线虫独有，它广泛存在于不同的动植物中[4]；在miRNAs储存数据库miRBase中列出了人类含有的1917个前体miRNAs(pre-miRNAs)和2654个成熟miRNAs[5]，超过60%的人类蛋白质编码基因含有预测的miRNAs靶点[6]，一个miRNA可以调节一个甚至几百个基因，而多个miRNAs也可以只调节一个基因。多项动物研究证实生成miRNAs的两种关键酶Dicer1、Drosha以及DiGeorge综合征关键区基因8(DiGeorge syndrome key region gene 8，DGCR8)的缺失导致动物模型表现出胚胎致死性，这表明miRNAs在哺乳动物发育、细胞分化和动态平衡中极其重要[7-8]。

1.1miRNAs的产生和作用机制miRNAs的产生是一个复杂的多步骤过程，主要通过RNA聚合酶Ⅱ、转录因子和RNA结合蛋白在细胞核中转录成发夹样的原始miRNAs(pri-miRNAs)，随后由DGCR8和内切酶Drosha组成的复合体特异性切割pri-miRNAs，得到约70个核苷酸组成的pre-miRNAs，同时输出蛋白5又将pre-miRNAs从细胞核转运到细胞质中进一步加工，由发夹酶Disher切割pre-miRNAs末端发夹结构样环后产生两条miRNA双链；RNA诱导沉默复合物与miRNAs双链中的一条形成miRNAs诱导的沉默复合物(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，另外一条miRNAs链则被舍弃；miRISC中的关键蛋白阿尔古2蛋白(argonaute 2 protein，AGO2)携带成熟的miRNAs识别位于靶mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)的互补序列，并促进mRNA的翻译抑制或降解[9-10]。

1.2miRNAs的功能miRNAs调控基因表达的功能决定细胞发育、增殖分化、死亡以及糖脂代谢等重要进程，具有广泛性和多样性。最初学者们认为miRNAs只在产生miRNAs的细胞中调节其靶mRNA的表达。然而，最新研究发现miRNAs也可以从细胞分泌到循环系统影响全身各个靶器官[11]，那么血清或体液中miRNAs则有望成为早期诊断各种代谢性疾病的生物标记物和潜在治疗靶点，如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等[12]。另有研究表明分泌的miRNAs，尤其是细胞外囊泡中分泌的miRNAs，如外泌体，可以介导不同组织之间的旁分泌和内分泌信号传导，从而调节基因表达和远端细胞功能[13]。

2 miRNAs与视网膜疾病的相关研究

miRNAs在视网膜正常发育、结构及功能中起着重要作用[14]。Karali等[15]利用高通量测序技术分析人类视网膜中miRNAs表达，研究数据显示几乎1/5已知人类miRNAs在神经视网膜中表达，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-96-5p、miR-124-3p、miR-9-5p。在视网膜表达的miRNAs中，90%以上存在同分异构体，已有研究证明，人类miR-204种子区修饰的异构体杂合突变是导致视网膜营养不良和双眼缺损的常染色体显性遗传病的原因[16]。这些在视网膜中特异性高表达的miRNAs不仅在维系视网膜功能方面具有重要的作用，且与视网膜疾病的发生发展以及预后转归也有密切联系。

3 miRNAs与DR的相关研究

目前研究较多的与氧化应激、炎症及VEGF等相关且在DR发生发展中发挥作用的miRNAs见表1。

表1 DR相关的miRNAs

3.1miRNAs与氧化应激和炎症氧化应激和炎症反应是参与DR的关键发病机制，高血糖诱导的晚期糖基化终末产物/受体、多元醇途径、蛋白激酶C激活和氨基己糖途径的增加，产生氧化应激、活性氧(ROS)积聚及细胞凋亡，促进促炎介质和趋化因子产生，诱发视网膜神经退行性改变，并导致血-视网膜屏障破坏、血管通透性增加及新生血管生成，加重DR神经血管功能障碍[17]。Chen等[18]研究发现miR-455-5p通过下调细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表达减少高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞内ROS、丙二醛以及NADPH氧化酶的含量，并抑制炎性因子白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放；此外，增强miR-455-5p的表达能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低Bcl-2凋亡蛋白的表达，表明miR-455-5p是通过靶向SOCS3抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，从而减轻RPE细胞的损伤，因此miR-455-5p可能成为治疗DR新的靶点。近期研究显示，miR-144-3p的过表达能通过下调核因子红系相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)及其抗氧化靶基因的表达加剧RPE细胞的氧化应激反应，而miR-144-3p抑制剂可保护动物模型RPE的完整性和功能，增强抗氧化基因的表达，减轻氧化应激，故miR-144-3p也具有延缓DR病程进展的作用[19]。

去乙酰化酶1(sirtuin 1，SIRT1)是miRNA-195的靶基因，具有抑制氧化应激和炎症反应的作用，Mortuza等[20]发现高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal endothelial cells，HRECs)中的miRNA-195与SIRT1表达呈负相关，抑制miRNA-195可以上调SIRT1的表达，从而促进抗氧化和抗炎作用，抑制HRECs凋亡，缓解DR微血管损伤。

3.2miRNAs与VEGF 高血糖导致缺氧引起血管内皮细胞功能异常和VEGF表达增加，VEGF诱导血管通透性增加以及新生血管生成是DR微血管病变的重要代偿反应[21]。同时，VEGF的表达水平也能反映早期DR的病情进展。

近年来已有研究证明miRNAs通过靶向3’UTR控制VEGF的表达影响DR发病，如增强miR-152的表达则直接作用于肾素受体3’UTR，下调肾素受体表达水平并调节肾素-血管紧张素系统，降低高糖条件下HRECs中VEGF、血管内皮生长因子受体-2(VRGFR-2)和转化生长因子β1的表达[22]，改善DR微血管病变。Yang等[23]利用生物信息学分析发现VEGF作为miR-15b的靶基因，miR-15b能下调VEGF的表达，RNA测序技术等发现增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的血液中循环miR-15b与VEGF直接相关，体外实验用miR-15b模拟物转染HRECs进一步证实miR-15b通过直接靶向VEGF的3’UTR区域调控VEGF转录，相反，在培养中过表达miR-15b可抑制VEGF的转录和蛋白表达，且呈剂量依赖关系；随后发现通过在糖尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠玻璃体内注射miR-15b又可以改善DR的病理指标，如微血管密度、血管迂曲、微动脉瘤、毛细血管无灌注和荧光素渗漏等。促血管生成因子VEGF-A通过促进内皮细胞的存活、迁移和增殖增强血管通透性[24]，与DR发病机制密切相关。与正常人相比，DR患者miR-200b表达降低，VEGF-A表达增加，且miR-200b可能通过下调靶基因VEGF-A mRNA的表达[25]延缓DR发生，因此miR-200b可能是治疗DR的一种有前景的靶点。

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是促进缺氧适应的转录因子，参与视网膜组织新陈代谢、应激和对低氧条件的适应，在多种缺血性和炎症性视网膜疾病中发挥关键作用，尤其是在DR中HIF会增加VEGF和其他缺氧调节基因产物的表达；VEGF的高表达会导致血管通透性增加、新生血管形成，并且会促进视网膜血管的闭合，从而形成无灌注区加剧缺血缺氧并产生恶性循环[26-27]。既往研究显示，在缺氧诱导的血管内皮细胞中miR-424表达增加并调节HIF-1α促进病理血管生成[28]。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)与VEGF的动态平衡对于DR病理血管生成十分关键，Wu等[29]研究发现miR-199a-3p直接抑制HIF mRNA转录从而减少VEGF表达，VEGF成为miR-199a-3p潜在靶点，PEDF是miR-363的潜在靶点，且miR-363在DR中表达增加，而miR-199a-3p表达下调，这表明miR-199a-3p和miR-363可能分别在DR发生发展过程中调节VEGF和PEDF的表达。近期研究发现，在DR患者的微血管内皮细胞中miR-150-5p降低和miR-21-3p、miR-30b-5p、HIF-1α升高可能共同导致异常血管生成，具体机制还需要进一步研究[30]。

3.3其它己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是葡萄糖代谢的关键因子，既往研究报道肝癌中上调的HK2可以促进内皮细胞血管生成，也是miR-384-3p的靶基因[31]，血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)可以促进内皮细胞迁移和血管生成[32]。近期研究发现DR小鼠中HK2、PECAM-1呈高水平表达，miR-384-3p是低表达状态，研究数据进一步证实miR-384-3p过表达通过下调HK2的表达抑制DR小鼠视网膜新生血管生成，体外实验证实miR-384-3p模拟物可降低HK2的表达，达到减少细胞增殖和视网膜微血管内皮细胞管状形成的目的[33]。

酸性鞘磷脂酶(ASM)是一种将鞘磷脂转化为促炎和促凋亡的神经酰胺酶，与其他视网膜细胞相比，糖尿病患者视网膜内皮细胞中ASM的激活程度最高，内皮细胞是ASM的主要来源[34]。Wang等[35]对DR患者HRECs中差异表达的miRNAs进行阵列整理分析后确定miR-15a可能是一种同时抑制ASM和VEGF-A激活的miRNA，体外研究表明miR-15a通过直接靶向ASM mRNA的3’UTR负向调节ASM的表达，且此研究中DR小鼠miR-15a的表达降低直接导致视网膜内ASM活化、VEGF-A及促炎因子的产生，导致视网膜内皮细胞通透性增加、细胞凋亡及血管生成。因此，miR-15a是针对DR抗炎和抗血管生成的双重靶点。

骨桥蛋白介导HRECs细胞外基质中Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)合成异常，从而导致基底膜增厚是早期DR最显著的特征，近期研究报道miR-29a是一种显著的针对和直接下调Col Ⅳ表达的miRNA，表明骨桥蛋白可能是通过抑制miR-29a途径上调HRECs中Col Ⅳ的表达参与DR发病机制[36]。

4 DR相关的循环miRNAs生物标记物

当细胞中miRNAs被动或通过微囊泡主动释放到血液或体液循环中，约有2wk的时间保持活性，它们在血浆、血清及尿液中冻融时的稳定性、高效回收和定量检测的有效性是成为生物标志物的可靠条件，也是一种潜在的生理和病理过程介体[37]。Zampetaki等[38]对300份1型糖尿病患者血清中的29个miRNAs进行定量对照，数据显示miR-27b和miR-320a显著且独立地与高DR风险相关，并通过对内皮细胞蛋白质组学分析证明miR-27b和miR-320a均以抗血管生成蛋白——血栓反应蛋白-1(TSP-1)为共同靶标调节血管生成，因此miR-320a和miR-27b可以成为诊治DR的潜在生物标志物。另一项关于1型糖尿病患者血清样本的大型前瞻性研究显示miR-126水平与糖尿病血管并发症尤其是PDR密切相关[39]。Ji等[40]通过验证分析DR患者血清中miRNAs发现，miR-3197和miR-2116-5p均有望成为诊断DR的生物标志物，但它们在DR发病中的分子机制仍不清楚。DR患者血浆中miRNAs的表达差异也很明显，近期临床研究表明miR-320a[41]、miR-328-3p[42]、miR-29c-3p[43]、miR-29和miR-200b[44]等均可作为DR 的新型生物标志物。因此，研究DR相关的循环miRNAs生物标志物可有助于指导临床表型的分类、诊疗随访方案的确立以及预后评价。

5小结与展望

DR作为一种可防性致盲性眼病，其关键在于早期预防，早发现、早诊治，因此，深入系统地研究DR发生的病理生理机制及其生物标志物是十分有必要的。miRNAs是一类新型的基因表达调控因子，它们不仅在DR的病因和病理中的作用已逐步被证明，并且与多种眼科疾病的发生、发展和转归密切相关[45]。miRNAs通过调控以VEGF为代表的各种关键因子进而调节DR发生发展过程中不同的病理变化，包括细胞增殖、凋亡、炎症反应、微循环损伤、氧化应激等，但miRNAs调控DR的确切分子机制及参与的关键信号通路等非常复杂，仍需要深入研究。因此，miRNAs拮抗剂或类似物作为一类新的药物可能有助于阻止或减缓DR病变的发生和发展。目前研究表明miRNAs具备易于检测、可预测DR进展病理机制及提供高效治疗干预手段等特点，是一种理想的有前景的生物标志物，但是其无法预测DR病情严重程度，也不能区分DR的分期阶段，目前针对DR患者的特异性与敏感性高的miRNAs改变还需要大量的临床病例研究，才能提高其临床应用价值，成为早期干预DR的有力依据与治疗方法，并且基于miRNAs配合抗炎、抗氧化等个性化联合治疗将有助于提高DR患者视觉质量和生活质量。