钛表面纳米管结构金纳米颗粒加载对成骨细胞MC3T3-E1功能影响的研究

徐博雅 宋文 何奕德 李哲 张玉梅

纳米粒子广泛应用于药物靶向递送、分子成像和组织工程等领域，其中金纳米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）由于它们独特的光电化学特性和良好的生物相容性备受关注［1］。研究表明，AuNPs是非常有吸引力的成骨材料，对骨改建相关的细胞，如成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞及骨髓间充质干细胞的作用显著［2－3］。因此，将 AuNPs引入牙种植体表面，可能是骨组织工程领域中极具吸引力的材料。

本研究设计并通过电沉积方式在钛表面纳米管上构建尺寸可控的金纳米粒子（AuNPs／NTs），评估该表面对MC3T3-E1细胞功能的影响，为钛种植体表面功能修饰提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

丙酮、无水乙醇、40%氢氟酸、85%磷酸（天津富宇精细化工）；MC3T3-E1细胞系（ATCC，美国）；α-MEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清、青霉素－链霉素、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒（PCM，美国）；基因引物（北京擎科泽西）；Trizol、逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒（TaKaRa，日本）；BCIP／NBT碱性磷酸酶显色试剂盒；茜素红（Sigma，美国）。

1.2 AuNPs／NTs的构建与表征

阳极氧化制备NTs：直径为 1.5 cm，厚度为1 mm的圆形钛片用砂纸进行打磨至表面呈光滑镜面，作为PT组。在400 mL去离子水中加入23 mL 85%的磷酸溶液和5 mL氢氟酸溶液制备电解液，在10 V电压下阳极氧化法制备纳米管，氧化时间1 h，作为NT组。

电沉积制备 AuNPs／NTs：以 NTs为工作电极，铂片为辅助电极，极间距 30 mm，在 0.1 mol／L HAuCL4／0.2 mol／L HBO3溶液中以5 V恒电压沉积，电沉积时间分别设置为5、10、30、60 min。沉积完毕后采用丙酮、无水乙醇、异丙醇、去离子水超声清洗。

材料表征：采用扫描电镜SEM对制备完成的试样进行表面观察。

1.3 细胞培养

小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1使用含10%胎牛血清的α-MEM培养基，添加100 U／mL青霉素和链霉素培养。当细胞生长到密度约80%后，采用胰蛋白酶消化传代、接种试样。成骨诱导液在生长培养基的基础上加入 0.108 g／mLβ-甘油磷酸钠（β-GP），50 μg／mL抗坏血酸（Vc）和 0.2μg／mL地塞米松。

1.4 细胞增殖功能检测（CCK-8实验）

将PT、NT和电沉积10 min制备的AuNPs／NTs放置于24孔板内，不含细胞的孔作为空白组，PT和NT作对照组，细胞以1×104／孔的密度接种到试样表面。每孔加入1 mL的α-MEM，在37℃，5%CO2条件下培养，分别在接种后的第1天、第3天、第5天及第7天进行测定。每孔中更换成500μL含10%CCK-8的培养液继续培养1 h后，利用酶标仪（Bio-Tek，美国）测定每孔450 nm处的吸光度。

1.5 成骨相关基因检测（RT-PCR）

细胞接种到不同试样表面贴壁1 d后更换为成骨诱导液培养3 d，每孔加入200μL Trizol裂解细胞，提取总RNA。利用 Nanodrop 2000（Thermo，美国）测定提取的细胞总RNA的浓度及纯度，使用TAKARA的prime script RT试剂盒反向转录逆转录获得cDNA模板，CFX96聚合酶链反应系统（Bio-rad，USA）进行定量聚合酶链反应。实验使用TB GreenⓇPremix Ex Taq II反应体系，两步法PCR扩增标准程序（Step 1：95℃变性30 s，Step 2：PCR反应扩增40个循环，Step 3：95℃退火5 s，60℃延伸30 s）。目的基因包括碱性磷酸酶ALP、Runt相关转录因子2 Runx2（runt-related transcription factor 2）、骨形态发生蛋白2 BMP-2（bone morphogenetic protein-2）、成骨相关转录因子抗体Osterix，骨桥蛋白 OPN（osteopontin）。管家基因选取GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），其引物序列及各目的基因的引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 RT-PCR primer sequences for RT-PCR

1.6 碱性磷酸酶（ALP）染色

细胞成骨诱导7 d后。采用BCIP／NBT碱性磷酸酶显色试剂盒对ALP进行染色，每孔加入染色液200 μL室温避光孵育过夜。加入去离子水中止染色后，取出材料置于体式显微镜下观察，拍照。

1.7 细胞外矿化基质染色及半定量分析

细胞成骨诱导14 d后弃去培养液，每孔加入500 μL茜素红染液，室温避光孵育5 min，加入去离子水中止染色，体式显微镜拍照观察。随后向各个孔中加入氯化十六烷基吡啶的洗脱液震荡30 min洗脱，使用酶标仪测定620 nm处洗脱液的A值并进行比较。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 试样表面观察

图1在为NTs上进行纳米金电沉积的SEM图像以及AuNPs直径与沉积时间的关系。结果显示AuNPs大小具有时间依赖性，随沉积时间延长而生长，且当时间继续延长至30 min，留存在NTs阵列内的AuNPs受到纳米管管径的限制，尺寸不再发生明显变化。发现电沉积10 min组的AuNPs／NTs表面金颗粒大小均匀且结构更为稳定，经筛选用于体外细胞实验，在后续实验中记录为AuNPs／NTs组。

图1 不同沉积时间钛表面AuNP／NTs阵列的FE-SEM俯视图和横截面图像Fig 1 FE-SEM top and cross-sectional images of AuNP／NTs arrays on titanium surface at different deposition times

2.2 AuNPs／NTs对细胞增殖的影响

如图2所示，成骨细胞在AuNPs／NTs表面接种培养，其数量随培养时间延长增殖。与PT组和NT组相比，虽然在培养第5、第7天后AuNPs／NTs表面的成骨细胞数稍有降低，但各时间点A值均未表现出显著差异（P＞0.05），表明 AuNPs／NTs材料纳米管及 Au的加入都不会降低其细胞增殖活性。

图2 MC3T3-E1细胞在3组样本表面的增殖活力（CCK-8法）Fig 2 The proliferation viability of MC3T3-E1 cells on the surface of the sample of the 3 groups（CCK-8 assay）

2.3 AuNPs／NTs对细胞成骨基因表达的影响

RT-PCR结果显示，与PT组相比，AuNPs／NTs组BMP-2表达量明显增加（图 3）（P＜0.01），Osterix和OPN与表达量减少（P＜0.05）。与NT组相比AuNPs／NTs组细胞 BMP-2和Osterix的表达上调了1.5倍（P＜0.05），OPN基因的表达上调了 1.2倍（P＜0.01），差异均表现出统计学差异。此外ALP和Runx2基因的表达也有一定上调，但结果未显示出无统计学差异（P＞0.05）。

图3 RT-PCR检测AuNPs／NTs对MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达的影响Fig 3 The effect of AuNPs／NTs on osteogenesis-related gene expression in MC3T3-E1 cells

2.4 AuNPs／NTs对细胞成骨向分化的影响

体式显微镜下观察发现各组均见深蓝色碱性磷酸酶结晶（图 4）。与PT组和NT组相比，AuNPs／NTs组可以观察到更多的深蓝色结节。茜素红溶液染色观察发现各组均可见深红色矿化结节（图 5）。其中AuNPs／NTs组表面显示出更多的矿化结节，且颜色最深。PT组表面的矿化结节最少。通过对矿化结节洗脱后测定620 nm处吸光度的半定量分析（图5），显示AuNPs／NTs组诱导小鼠MC3T3细胞外基质矿化能力最强，且显著高于PT组和NT组，PT组和NT组间半定量结果无统计学差异。

图4 不同材料表面MC3T3细胞ALP染色Fig 4 ALP staining of MC3T3 cells on different material surfaces

图5 不同材料表面MC3T3细胞茜素红染色及半定量分析Fig 5 Alizarin red staining of MC3T3 cells on the surface of different materials

3 讨 论

促进种植体周围骨组织再生是提高种植体的存活率的关键。金纳米粒子以其优异的低细胞毒性和高生物相容性广泛应用于生物诊断、药物递送等医学领域［4－5］。金纳米粒子能与成骨细胞相互作用，促进新骨沉积［6］，同时在骨改建的过程中抑制破骨分化［7］。基于这些原因，我们制备了AuNPs功能化的钛纳米管种植体，以促进细胞成骨分化，为增进口腔种植体的骨组织结合提供依据。

AuNPs的制备工艺多样，目前常用的方法有化学还原方法［8］以及沉积［9－11］、溅射［12］等物理方法，其中电化学还原沉积法技术成熟［13］。基本原理是电解质中的Au3＋在多孔的纳米模板表面得到电子还原形成金体。本研究发现随着沉积时间的延长，位于纳米管内的金纳米球表现出生长受限，提示纳米管状阵列对金的生长起到一定的空间限制作用。

Zhang等［14］发现20 nm和40 nm的 AuNPs提高人牙周膜祖细胞成骨向分化，促进矿化结节形成；Ko等［15］在不同尺寸中筛选出30 nm和50 nm的AuNPs促进间充质干细胞的成骨分化最为有效。在本研究中，使用了直径为50 nm的钛纳米管作为电沉积的模板，并在其上合成出平均直径在30～50 nm的金纳米粒子。体外细胞实验结果表明，AuNPs／NTs可以显著增加成骨分化特异性标记物如 BMP-2，Osterix和OPN基因的表达。BMP-2是TGF-β超家族中的骨生长调节因子［16］。有研究表明，AuNPs可能作为机械刺激激活 MAPK信号通路，促进 BMP-2／smad／Runx2信号通路的表达进而促进成骨［17－18］。OPN与 Osterix是骨基质的形成所必需的特异性转录因子［19］，Osterix可以受到BMP-2通过Dlx5诱导而表达升高［20］。尽管在PCR检测的早期（3 d）由于时间原因，BMP-2和Runx2表达升高，而ALP的表达未形成显著累积。但基于7 d的 ALP／AKP染色结果认为，AuNPs／NTs组染色更深代表碱性磷酸酶的活性更高。此外，AuNPs／NTs组显示出明显高于其他组的钙结节沉积。由此可见相比于光滑表面和纯纳米管表面材料，AuNPs的掺入促进成骨向分化，可用作促进骨整合的牙种植体表面修饰，以改善种植体植入后的骨形成。

本研究在良好的二氧化钛纳米管制备工艺基础上，探索了电沉积形成AuNPs的相关特征及生物学功效，为钛种植体表面功能化修饰提供了新的研究方向。此外，本研究尚存在不足之处，对于纳米管径限制AuNPs生长的规律探索不够清楚，且AuNPs促进成骨分化的机制尚有待进一步的探索。