国产色谱柱HPLC法测定竹子乙醇精炼液中单糖与小分子脂肪酸

王 森 森， 平 清 伟， 盛 雪 茹， 李 娜， 张 健

( 大连工业大学 轻工与化学工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

高效液相色谱法(HPLC)可用于试样中混合物质的分析[1-2]，常用于生物质组分的分离和检测[3]，比如单糖检测、原料成分和聚糖的降解分析等[4-6]。市场上HPLC法检测糖类的色谱柱多以进口为主，价格昂贵。国产氨基柱pH耐受范围更广，使用和再生条件相对简单，可做正相也可做反相使用，价格也比较低廉[7]。C-18柱价格相对便宜，应用广泛[8]。进口C-18色谱柱经常被用于脂肪酸的检测[9]，国产C-18色谱柱检测乙醇水溶液中的乙酸时会受到乙醇的严重干扰[10]。

生物质乙醇法精炼具有溶剂可回收、绿色无污染、效益高等优点，一直备受瞩目[11-12]。我国盛产竹子，撑篙竹在我国广东、河北、江西都有广泛分布[13]。撑篙竹乙醇法精炼液中富含甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸和各种降解糖，具有较高经济价值，但其中也含有乙醇，会对HPLC法测量小分子脂肪酸含量带来干扰。本研究使用国产氨色谱柱和C-18色谱柱分别检测撑篙竹乙醇法精炼水解液中降解单糖与小分子脂肪酸含量，以期为用HPLC法测试含乙醇的小分子脂肪酸样品提供借鉴。

1 实 验

1.1 主要原料与试剂

竹片(韶关市)，平衡水分密封；磷酸、乙腈、甲醇、乙醇，均为色谱纯试剂。

1.2 撑篙竹乙醇法精炼

将竹片和50%(体积比)乙醇水溶液按液比1∶10(g/mL)放入高温反应釜中，在185 ℃保温240 min后冷却至40 ℃，放出浆料，用40 ℃左右50%乙醇水溶液洗涤干净，收集精炼液。所得浆料风干后密封。

1.3 水解单糖的制备

参照文献[8]方法水解原料和浆料，用HPLC法测水解单糖量(mg/L)并按公式(1)计算糖降解率。

(1)

1.4 小分子脂肪酸的提取

精炼液成分十分复杂[14]，不能直接测量小分子脂肪酸含量。取50 mL精炼液，减压旋蒸得到馏分，定容至50 mL。该馏分中含乙醇、水和甲酸、乙酸等小分子脂肪酸。

1.5 HPLC法测定单糖和小分子脂肪酸

1.5.1 流动相配制

参照文献[15]方法和进口色谱柱测试经验，配制不同种类、不同体积比的流动相。

1.5.2 标准糖液、标准酸液配制

分别配制1、2、4、6和8 g/L葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的标准单糖溶液各50 mL，绘制标准曲线。

分别配制5、10、20、40和80 mL/L甲酸、乙酸和丙酸标准溶液50 mL，绘制标准曲线。

1.5.3 单糖和小分子脂肪的测定

使用高效液相色谱仪(Waters公司)测定单糖和小分子脂肪酸。单糖用国产氨基柱(填料：Hypersil NH2-S 5 μm；柱长：250 mm；管径：4.6 mm)测量，小分子脂肪酸用国产C-18柱(填料：Supersil ODS-B 5 μm；柱长：250 mm；管径：4.6 mm)测量。与进口某品牌糖柱和C-18柱的测试结果对比，分别计算单糖和酸的相对偏差率。

单糖的相对偏差率=[(a-b)/a]×100%

(2)

酸的相对偏差率=[(c-d)/c]×100%

(3)

式中：a、b为国产氨基柱和进口糖柱的糖降解率，按式(1)计算；c、d分别为国产和进口C-18柱测得的酸浓度。

2 结果与讨论

2.1 国产氨基柱糖分离条件的优化

表1为国产氨基柱检测标准单糖的条件和出峰时间。出峰时间差越大，分离效果越好。

2.1.1 流动相种类的影响

表1中编号A、B、C的流动相为甲醇-水和乙醇-水时标准糖出峰效果都不理想。流动相为乙腈-水可以使葡萄糖和木糖分开，但阿拉伯糖和半乳糖没有分开。乙腈-水的效果相对较好，用乙腈-水为流动相。

2.1.2 流动相比例的影响

表1中编号D、E流动相乙腈和水体积比为80∶20时标准糖出峰不好，体积比为77∶23时，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖可以分开，与75∶25(编号C)相比，虽然Δt1(t2-t1)、Δt2(t3-t2)更大一些，但此时木糖与阿拉伯糖峰有拖尾现象，因此流动相体积比固定为75∶25。

2.1.3 测试温度的影响

表1中编号F、C、G、H的测试温度分别为20、25、30和35 ℃。可以看出，温度对出峰时间影响较大，温度越高出峰时间越早，且温度高分离效果会变好一些。35与30 ℃相比，虽然出峰略好，但温度越高柱压越高，不利于色谱柱的使用与再生，因此选择30 ℃测试温度进行研究。

2.1.4 体积流量的影响

表1中编号I、J、H、K的体积流量由0.8 mL/min 升至1.2 mL/min。体积流量越大，出峰越早，但阿拉伯糖与半乳糖峰都有重叠，考虑到体积流量越低测试时间越长，测试效率越低，因此固定体积流量为1.0 mL/min。

表1 国产氨基柱单糖检测条件Tab.1 Detection conditions of monosaccharides by domestic amino column

2.1.5 进样体积的影响

表1中编号G、L1、L2研究了进样体积对糖分离效果的影响(流动相为乙腈-水，体积比75∶25，体积流量1.0 mL/min，时间15 min，温度30 ℃)。从表1中可以看出，进样体积从20 μL 减少至10和1 μL后，4种糖分离效果变好，进样体积10和1 μL出峰时间相同。从图1中也可以看出，进样10 μL的基线不如进样1 μL平稳，进样1 μL效果最佳。

G，进样20 μL；L2，进样1 μL图1 进样体积对单糖的分离效果Fig.1 The effect of injection volume on the separationof monosaccharides

国产氨基柱HPLC法测量单糖的较优条件为：乙腈-水为流动相，体积比75∶25，进样体积1 μL，体积流量1.01 mL/min，时间15 min，温度30 ℃。用加标法得到定量计算单糖的线性回归方程。由表2可知，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖对应的线性方程都有较好相关系数，R2≥0.998。

表2 4种标准单糖定量计算的线性回归方程Tab.2 Linear regression equation for quantitative calculationof four standard monosaccharides

2.2 国产C-18柱测定小分子脂肪酸

国产C-18柱检测小分子脂肪酸的条件见表3。表3中，编号M～Q检测条件参照进口C-18柱色谱柱测定小分子脂肪酸常用条件制定[9]。

国产C-18柱在编号M～Q条件下，甲酸出峰效果都很差，基线不稳且有拖尾现象。降低流动相中乙腈的比例至70%(编号R)，出峰效果未见好转(图2)。

表3中编号S～W为国内酿酒行业检测乙醇中甲酸、乙酸含量所用条件[10]。编号S、U的甲酸出峰效果虽然有所好转，但基线仍然不稳定，且有拖尾现象(图3)。

继续降低乙腈比例，减至60%(编号X)时，甲酸出峰效果明显变好(图4)。

表3 国产C-18柱小分子脂肪酸检测条件Tab.3 Detection conditions and preliminary results ofsmall fatty acidby domestic C-18 column

图2 编号R的甲酸出峰效果Fig.2 The peak of No.R formic acid

图3 编号S、U的甲酸出峰效果Fig.3 The peaks of No.S and No.U formic acids

将配制的甲酸、乙酸、丙酸和乙醇混合溶液继续降低流动相乙腈的比例至50%，进样量也减小到1 μL(编号Z)，甲酸、乙酸和丙酸的分离效果好且无乙醇干扰峰(图5)。

图4 编号X的甲酸出峰效果Fig.4 The peak of No.X formic acid

图5 编号Z 3种酸的分离效果Fig.5 The peaks of three types of No.Z acids

国产C-18柱LPLC法测量含乙醇的小分子脂肪酸混合液较优测量条件：流动相乙腈与水体积比50∶50，进样体积1 μL，时间15 min，体积流量0.6 mL/min，温度25 ℃。用加标法得到脂肪酸定量计算线性回归方程见表4。

表4 甲酸、乙酸和丙酸的定量计算Tab.4 Quantitative calculations of formic， aceticand propionic acids

2.3 与进口色谱柱实际测试对比分析

2.3.1 精炼液中糖降解情况

国产氨基柱按优化好的条件测量原料、浆料水解液中的单糖，进口糖柱按表2中编号A条件测量。糖的降解率和相对偏差如表5所示。两种色谱柱都只检测到了葡萄糖和木糖。国产色谱柱与进口色谱柱相比，两者木糖的相对偏差率较小，葡萄糖的相对偏差率略大，但偏差率绝对值都在5%以内。国产氨基柱用于HLPC法检测生物质水解液中混合单糖含量比较可靠。

表5 降解糖的检测结果Tab.5 The detecting results of degraded sugars

2.3.2 精炼液中小分子脂肪酸含量

按优化好的小分子脂肪酸检测方案，用国产C-18柱检测撑篙竹乙醇法精炼液中小分子脂肪酸含量。与用进口C-18柱(表4中编号M方案)的检测结果对比，两种色谱柱都检测到了乙酸、甲酸和丙酸，酸的相对偏差如表6所示。国产C-18柱与进口C-18柱相比，两者乙酸和甲酸的相对偏差率较小，绝对值都在5%以内。丙酸的相对偏差率较大，绝对值在5%以上，原因是样品中丙酸浓度很低，极小的绝对误差就可能造成相对偏差率增大。初步研究结果表明，国产C-18柱可用于HLPC法检测生物质水解液中甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的含量。

表6 甲酸、乙酸和丙酸的检测结果Tab.6 The detecting results of formic， acetic andpropionic acids

3 结 论

国产氨基色谱柱、国产C-18色谱柱可用于检测撑篙竹乙醇法蒸煮过程中糖的降解情况、小分子脂肪酸的生成情况，与进口色谱柱相比，检测结果可靠，相对偏差率较小。

国产氨基色谱柱，以乙腈-水为流动相，在体积比75∶25、进样体积1 μL、体积流量1.01 mL/min、时间15 min和检测温度30 ℃的条件下，可以实现对生物质水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的定性、定量检测。

国产C-18色谱柱，以乙腈-水为流动相，在体积比50∶50、进样体积1 μL、体积流量0.6 mL/min、时间15 min和检测温度25 ℃的条件下，可以在含乙醇生物质水解液中实现对甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的定性、定量检测。