棕榈硬脂油和菜籽油制备USU型结构脂优化条件研究

姚辉耀， 王福超，2， 张 华* ， 尹星福*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；2.锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000)

结构脂质指具有特定功能，采用人工方法生产的三酰基甘油酯，这种三酰基甘油酯含有附着在甘油主链上的多种短链、中链和长链脂肪酸[1]。不饱和-饱和-不饱和(USU)型结构脂是指通过酶法脂交换技术模拟母乳脂质分子结构，使其甘油酯二位(Sn-2)为饱和脂肪酸，一，三位(Sn-1,3)上连接不饱和脂肪酸，在结构上更接近母乳水平的一种结构脂。

人乳脂肪中的甘油三酯含量占整个脂肪的98%以上，60%以上的棕榈酸(为饱和脂肪酸)分布在甘油三酯的Sn-2位，其他的不饱和脂肪酸主要分布在Sn-1,3位，即属USU型，如1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)和OPL等[2]。这种结构脂，经过消化吸收后，优先释放出来1,3位上的不饱和脂肪酸，很容易被肠道吸收进入到血液中，2位上的棕榈酸也很容易被肠道所吸收，同时也促进维生素和矿物质的吸收[3]。在母乳供应不足的情况下，婴幼儿的配方奶粉成为提供婴幼儿营养的最佳选择，但目前国内市场的很多配方奶粉中的脂肪多为调配的植物油，脂肪酸组成与分布都与母乳脂肪差别很大，这些差异会造成婴幼儿在消化吸收奶粉脂肪过程中出现钙皂等问题，影响婴幼儿对脂肪和钙的吸收[4]。在部分发达国家，结构脂质已实现工业化生产，并进入市场。国外相关研究中，Quinlan等[5]以Rhizomuco miehei 脂肪酶为催化剂，三棕榈酸甘油酯和油酸为原料进行酸解反应。Jiménez等[6]通过两步酸解法，OPO最佳的得率可达到96%。但我国在这一领域的研究尚处于起步阶段。黄磊等[7]以巴沙鲶鱼油和葵花籽油的游离脂肪酸为原料，用 Lipozyme RM IM脂肪酶为催化剂，制备了富含OPO的结构脂；蒋与燕等[8]以三棕榈酸甘油三酯(PPP)和油酸(OA)为原料，脂肪酶RMIM作催化剂，反应制备出OPO结构油脂；邹孝强等[9]以LipozymeRM IM为催化剂，通过在填充床反应器中酸解巴沙鲶鱼油，调节巴沙鲶鱼油中的棕榈酸、亚油酸含量及Sn-2位棕榈酸相对含量。

棕榈硬脂油Sn-2位上富含饱和脂肪酸，棕榈酸含量为72.04%，硬脂酸含量为9.32%[10-12]；芥菜籽油富含亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸，二者是制备USU型结构脂的理想原料。因此，该试验用Lipozyme TLIM脂肪酶催化芥菜籽油乙酯与棕榈硬脂油，反应制备USU型结构脂。根据酶添加量、反应时间、底物摩尔比，在单因素试验的基础上进行正交优化实验，得到最佳工艺条件。为实现USU型结构脂利用于人乳替代脂，实现产业化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棕榈硬脂油(奥斯利化工有限公司，济南)；芥菜籽油(中企华业食品有限公司代理，北京)；固定化脂肪酶(Lipozyme TLIM，诺维信，丹麦)；氢氧化钾；无水乙醇；正己烷；无水硫酸钠；乙醚；醋酸(阿拉丁试剂有限公司，上海)均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平(JA1003J，上海雷韵试验仪器制造有限公司，上海，中国)；自动控温往复式水浴摇床(DP-SHA-B,北京亚欧德鹏科技有限公司，北京，中国)；高速离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂，上海，中国)；磁力搅拌器(HJ-4，金坛市易晨仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(上海一科仪器有限公司)；手提式紫外分析仪(WHF-204B，杭州市齐威仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 不饱和脂肪酸乙酯的制备

取120 g芥菜籽油于圆底烧瓶中，加入36.8 g无水乙醇(醇油摩尔比6∶1)，1.2 g氢氧化钾(芥菜籽油质量的0.23%)，用加热磁力搅拌器在78 ℃、120 r / min下冷凝回流反应30 min。反应后移入分液漏斗内，冷却后加入100 mL正己烷，充分震荡后加入50 mL热蒸馏水洗涤，待溶液澄清后放掉下层液体，多次水洗直至乳化层消失。取上层澄清液体通过装有无水硫酸钠的层析柱除去多余的水分，用旋转蒸发仪除去混合液中的正己烷，得到不饱和脂肪酸乙酯。

1.3.2 USU型结构酯的制备

50 mL离心管中放入一定摩尔比的棕榈油和芥菜籽脂肪酸乙酯，在水浴摇床中加热到50 ℃后，加入一定比例的脂肪酶 Lipozyme TLRM，反应一定时间后取出，得到含有产物和游离脂肪酸的混合物。

放入离心机中以4 000 r/min的转速离心5 min，取上层液体加入等体积正己烷，混匀后加入热蒸馏水洗涤，静置分层后分别收集上层和下层液体，其中下层液体重复清洗3次至乳化层完全消失。上层液体合并后用无水硫酸钠去水，将其过滤后，用旋转蒸发仪将正己烷完全去除后称重即为结构脂的重量。结构脂得率按照下式计算：

1.4 单因素试验

1.4.1 不同反应时间对结构脂得率的影响

将棕榈油和芥菜籽油脂肪酸乙酯按1∶3的摩尔比混合，加入混合物质量4%的脂肪酶Lipozyme TLIM，在自动控温往复水浴摇床中以120 r/min、55 ℃下分别反应2、3、4、5和6 h，计算得率，试验重复3次。

1.4.2 不同摩尔比对结构脂得率的影响

将棕榈油和芥菜籽油脂肪酸乙酯分别按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5(mol∶mol)的摩尔比混合，加入混合物质量4%的脂肪酶 Lipozyme TLIM，在自动控温往复水浴摇床中以120 r/min、55 ℃反应4 h后，计算得率，试验重复3次。

1.4.3 不同酶添加量对结构脂得率的影响

将棕榈油和芥菜籽油脂肪酸乙酯按1∶3的摩尔比混合，分别加入混合物质量2%、3%、4%、5%和6%的脂肪酶Lipozyme TLIM，在自动控温往复水浴摇床中以120 r/min、55 ℃反应4 h后，计算得率，试验重复3次。

1.5 正交试验

通过单因素试验可以确定适宜的脂肪酶添加量、底物摩尔比和反应时间，由此以脂肪酶添加量、底物摩尔比和反应时间为考察因素，分别选取3个水平，以USU型结构酯得率为指标进行L9(34)正交试验。因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.6 脂肪酸乙酯定性分析

为验证制备的菜籽油脂肪酸乙酯，对酯化产物进行薄层层析分析。用正己烷∶乙醚∶冰乙酸(体积比90∶10∶1)混匀配制展开剂后，倒入展开缸中，密封备用。

将菜籽油、菜籽油乙酯、油酸乙酯标品与正己烷以1∶20的比例混合均匀备用。用移液枪吸取样品20 μL于离心管中，加入5 mL展开剂。

将硅胶G板放在105 ℃烤箱内烤2 h进行活化，点样时点样线距底部2 cm，用移液枪吸取样液5 μL于点样线上。将硅胶板迅速放入展开缸中进行展开，待展开剂前沿走至距板上端1 cm时取出，自然晾干后将薄层板在紫外分析仪照射下显示图谱。

1.7 油脂结构和脂肪酸组成

利用高效液相色谱仪(HPLC)进行了油脂结构分析。HPLC条件为：色谱柱Zorbax SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温55 ℃；流动相流速为1 mL/min；进样量为5 μL；流动相为乙腈(A)和二氯甲烷(B)梯度洗脱，洗脱程序为0 min时A流动相为70%，5 min时A流动相为50%，25 min时A流动相保持50%，35 min时A流动相为30%，40 min时A流动相为70%[13]。

利用气相色谱仪(GC)分析了脂肪酸组成。称取30 mg样品，加入1.5 mL 0.5 mol/L甲醇钠，充分混匀后在90 ℃反应3 min，冷却，再加入2 mL 体积分数14% 的BF3甲醇溶液继续在90 ℃条件下反应2 min，冷却后加入1 mL饱和氯化钠和2 mL异辛烷，提取脂肪酸甲酯，经过无水硫酸钠干燥后用于GC分析。配有自动进样器和火焰离子化检测器，色谱柱为石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.2 μm)。GC分析条件：柱温先在100 ℃保温5 min，采用程序升温，以4 ℃/min升至220 ℃保持20 min。载气为N2，总气体流速为50 mL/min，进样口和检测器的温度分别为250和260 ℃[14]。

1.8 数据分析方法

采用SPSS.20.0进行数据分析，软件中的Duncan检验法对差异显著的数据进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 脂肪酶添加量对结构脂得率的影响

由图1通过显著差异进行分析，脂肪酶添加量为5%与6%之间无显著性差异，其余各组均与脂肪酶添加量5%有显著性差异。

图1 酶添加量对结构脂得率的影响

随着脂肪酶添加量的增加，结构脂得率呈先上升后趋于稳定的状态。当添加量为5%时得率最高。这是因为在脂肪酶添加量低于5%时，促进酰基的转移，使反应向结构脂生成方向进行；脂肪酶添加量大于5%时结构脂得率趋于平稳，可能是脂肪酶与底物的结合率已经达到饱和。

2.2 反应时间对结构脂得率的影响

由图2可以看出，当反应时间为4 h时，结构脂的得率最高，反应时间在2～4 h时，反应物浓度大于生成物浓度，反应整体趋向正反应方向，使得结构脂的得率持续增加，而从4 h过后脂肪酸甲酯的产率趋于平缓无显著性差异，但得率略有下降，可能是因为随着反应时间的延长，酯化反应已经开始向逆反应方向进行，使得结构脂的得率降低，因此，优选的反应时间是4 h。

图2 反应时间对结构脂得率的影响

2.3 底物摩尔比对结构脂得率的影响

由图3可以看出，摩尔比为1∶3、1∶4和1∶5之间不存在显著性差异，其余各组均具有显著差异。当底物摩尔比为1∶4时，结构脂得率最高。由于该试验用脂肪酶切割甘油三酯1，3位脂肪酸，再由不饱和脂肪酸替代，理论上底物摩尔比为1∶2。底物摩尔比在低于1∶3时，底物浓度大于生成物浓度，反应整体趋向正反应方向，使得结构脂得率持续增加，而大于1∶3时，结构脂产率开始趋于平稳。从经济合理的角度考虑，选取较优的反应底物摩尔比为1∶3。

图3 底物摩尔比对结构脂得率的影响

2.4 最佳反应条件的确定

通过L9(34)正交试验，由表2中R值可以看出脂肪酶添加量、反应时间、底物摩尔比对USU型结构脂得率的影响主次顺序为A>C>B，即最主要的影响因素为酶用量，其次是摩尔比，最后为反应时间，由K值可以确定各因素和水平间最佳组合为A1B1C3，而试验最佳结果组合为A1B3C3。通过验证试验确定最佳试验方案为A1B3C3，即酶添加量4%，反应时间5 h，底物摩尔比1∶4(mol/mol)。

表2 结构脂酯交换反应研究L9(34)试验结果

2.5 薄层层析法定性分析

对芥菜籽油，芥菜籽油乙酯以及油酸乙酯标准品进行薄层层析分析结果表明(图4)，制备的芥菜籽油乙酯产物中除脂肪酸乙酯以外无其它副产物。

图4 薄层层析显色照片

2.6 脂肪酸组成分析及甘油三酯结构分析

从气相色谱图峰面积百分比可以看出(表3)，棕榈硬脂油Sn-2位主要饱和脂肪酸为C16∶0(棕榈酸)、C18∶0(硬脂酸)，饱和脂肪酸占比为81.3%，芥菜菜籽油主要脂肪酸包括C18∶1(油酸)、C18∶2(亚油酸)、C18∶3(亚麻酸)和不饱和脂肪酸总含量为90.8%(表3)。表明适合制备USU型结构酯。

表3 脂肪酸组成

选用棕榈硬脂油与荠菜籽油乙酯(1∶4，mol/mol), 添加4%TLIM(w%)脂肪酶，反应5 h得到了Sn-2位棕榈酸(C16∶0)含量为54.5%，Sn-1,3位油酸含量51.9%(表3)，1,3-二油酸-2-棕榈酸结构脂(OPO)含量为25.3%的USU型结构酯(表4)。该试验结果与Jeung等[15]利用棕榈硬脂丙酮物理分提物与油酸乙酯反应得到OPO(31.4%)的结果相似。

表4 ELSD-HPLC分析和Sn-2位棕榈酸总和

3 讨论

酶促酯交换反应是制备结构脂的常用方法，具有高度专一性和高效率等特点，但对于反应条件有一定要求。酶法制备OPO的方法可以分为酯化法、酸解法和转酯法。Pfeffre等[16]先将棕榈酸甘油三酯转化成为2-棕榈酸甘油一酯，然后通过脂肪酶CALB催化2-棕榈酸甘油一酯与油酸酯化反应合成OPO，制得OPO的纯度为95%，得率为90%。该法虽然能合成较高纯度的OPO，但增加了甘一酯的制备与纯化工序，增加了生产成本。Nagao等[17]将棕榈酸甘油三酯与油酸按质量比1∶2混合均匀，加入8%热稳定性脂肪酶R275A，在50 ℃下反应24 h，得到36%的OPO。Silva等[18]通过脂肪酶Lipozyme TL IM催化猪油和大豆油的混合物发生转酯反应，制备的产品物理特性与人乳脂相似，但脂肪酸组成和脂肪酸结构与人乳脂存在差异。研究发现，当脂肪酸甲酯或乙酯作为酰基供体时，相对于脂肪酸作为酰基供体有更高的插入率，同时具有较低的酰基转移[19-21]。但由于反应产物中含有未反应的芥菜籽油脂肪酸乙酯、棕榈硬脂以及产生的甘一酯、甘二酯，因此需要进一步纯化。该研究以棕榈硬脂油和芥菜籽油为原料，利用酶促酯交换反应制备USU型结构脂。研究了底物摩尔比、脂肪酶添加量和反应时间3个因素对结构脂得率的影响，通过正交试验对结构脂最佳制备条件进行了优化。酶促酯交换反应是制备结构脂的常用方法，这种方法虽然具有高度专一性和高效率等特点，但其对于反应条件有一定要求，因此适宜反应条件的筛选就成为提高产物产率的重要措施。

4 结论

该试验结果表明，芥菜籽油含有多种脂肪酸，其中，不饱和脂肪酸含量90.8%，棕榈硬脂油Sn-2位棕榈酸含量72.0%，满足USU型结构脂对反应底物的要求。通过正交试验确定棕榈油和芥菜籽油脂肪酸制备USU型结构脂的最佳工艺条件为：酶添加量4%、反应时间5 h、底物摩尔比1∶4(mol∶mol)，此条件下结构酯得率最高，得到Sn-2位的棕榈酸含量在61.9%的各种结构USU型结构酯。