薰衣草精油纳米乳的制备及其体外抑菌活性研究

钱 雪，王晓东，陈 斌，罗伟康，杨建新，李海涛，黄晓德

（1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；3.丹东市农业农村发展服务中心，辽宁 丹东 118017；4.伊犁紫苏丽人生物科技有限公司，新疆 伊犁 835008）

薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）为唇形科薰衣草属植物。薰衣草精油是从薰衣草中提取出来的挥发性成分，具有特殊的芳香，主要含有芳樟醇、乙酸芳樟脂、薰衣草醇和樟脑等多种成分［1-2］，其中芳樟醇和乙酸芳樟脂的含量占薰衣草精油含量的70%以上［3-4］，具有抑菌、抗炎、抗焦虑等作用［5-7］，在化妆品和医药方面有广泛的用途，如降血压、治疗烧伤、安神助眠等［8-10］。但薰衣草精油水溶解度低、易挥发、不易储存且生物利用度较低，致使其应用受到了限制。纳米乳是一种粒径为10～100 nm的胶体分散体系，是稳定的热力学系统，主要由油、水、表面活性剂和助表面活性剂组成［11］。精油制成的纳米乳具有质量稳定、不易挥发、保存时间长、可长久留香和精油功效作用持久等特点［12-14］。近年来，将植物精油制备成不同载药体系的研究越来越多，然而对薰衣草精油纳米乳的研究相对较少。

因此，为了有效提高薰衣草精油的稳定性和生物利用度，实验中以薰衣草精油为主药和油相，采用相转变法制备薰衣草精油纳米乳，伪三相图法筛选最优表面活性剂和助表面活性剂，得到最优配方，并考察纳米乳理化性质和抑菌活性，为薰衣草精油的开发利用提供基础。

1 材料与试剂

1.1 材料

薰衣草精油，宏芳香料（昆山）有限公司；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）由南京野生植物综合利用研究院提供。

1.2 试剂

吐温-80（Tween-80），南京古田化工有限公司；氢化蓖麻油（CO-40）、蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、1，2-丙二醇和甘油，山东优索化工科技有限公司产品；聚乙二醇-400（PEG-400），国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水（自制）；其他试剂为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

BSA423S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪（英国Malvern公司）；Tecnai 12透射电子显微镜（荷兰Philips公司）；FE 28 pH计（梅特勒-托力多仪器（上海）有限公司）。

2 试验方法

2.1 薰衣草精油纳米乳制备方法

将油相和表面活性剂按比例混合均匀，向其中缓慢滴加蒸馏水，边加边搅拌，开始时体系黏度较低，形成油包水（W/O）型纳米乳，随着水量的增加，体系黏度逐渐增加，继续滴加蒸馏水，体系又会突然由黏变稀，此时W/O型纳米乳发生转相，即形成水包油（O/W）型薰衣草精油纳米乳［15］。

2.1.1 表面活性剂的选择

选用乳化效果较好的Tween-80、CO-40和EL-40作为表面活性剂，按表面活性剂与精油质量比为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，搅拌均匀，继续振荡下，用蒸馏水滴定，观察是否有澄清透明的纳米乳形成［16］。

2.1.2 助表面活性剂的选择

将CO-40与无水乙醇、1，2-丙二醇、甘油和PEG-400分别按3：1混合，按混合表面活性剂与精油质量比为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，搅拌均匀，继续振荡下，用蒸馏水滴定，观察是否有澄清透明的纳米乳形成［15］。

2.1.3 Km值的确定

Km值为表面活性剂和助表面活性剂比值［15］。将表面活性剂与助表面活性剂按质量比为2：1、3：1、4：1混匀，然后分别与精油按质量比为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合，搅拌均匀，继续振荡下，用蒸馏水滴定，观察是否有澄清透明的纳米乳形成。

2.1.4 薰衣草精油纳米乳配方的优化

根据选定的表面活性剂、助表面活性剂和Km值，采用伪三相图法确定纳米乳最优配比。分别按混合表面活性剂与精油质量比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合，搅拌均匀，用蒸馏水滴定，观察是否有澄清透明的纳米乳形成，并对制备的纳米乳加蒸馏水稀释后观察其稳定性情况［17］。

2.2 薰衣草纳米乳的质量评价

2.2.1 乳剂类型的判别

根据染料苏丹红和亚甲基兰在纳米乳中的扩散快慢进行判别，若红色扩散速度快，则为油包水（W/O）型；若蓝色扩散速度快，则为水包油（O/W）型［18］。

2.2.2 pH值

取适量薰衣草精油纳米乳，用pH计测试其pH值。

2.2.3 粒径分布及多分散系数

取薰衣草精油纳米乳1 mL，装入比色皿中，采用粒径分析仪测定纳米乳的粒径分布、多分散性系数和电位分布。

2.2.4 微观形态观察

取适量纳米乳，滴在有支撑膜的铜网上，使其自然晾干，后滴加2%磷钨酸溶液，负染，挥干，用透射电子显微镜观察［18］。

2.3 纳米乳中薰衣草精油含量的测定

2.3.1 紫外检测波长的选择

配制一定浓度的薰衣草精油甲醇溶液，以甲醇为空白，进行紫外波长扫描，确定其测定波长。

2.3.2 标准曲线的建立

制备薰衣草精油溶液标准系列浓度（0.048、0.144、0.240、0.336和0.432 mg/mL），以甲醇为空白，在231 nm波长处测吸光度（A）。

2.3.3 溶液的制备

精密吸取薰衣草精油纳米乳1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇5 mL破乳，超声10 min，用甲醇稀释至刻度，再精密吸取破乳液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得样品溶液。称取不含薰衣草精油的纳米乳样品1 mL，同法制备，做阴性对照溶液。

2.4 薰衣草精油纳米乳抑菌活性

纳米乳抑菌圈直径：参考文献的方法［19-20］，稍作修改。用滤纸片法测量抑菌圈直径，用二甲基亚砜将薰衣草精油稀释至与纳米乳中精油浓度相同，以生理盐水为溶剂，配制浓度为5.00 mg/mL的青霉素标准液。将已灭菌的固体培养基倒入培养皿中，供试菌种均匀的涂布在培养基上，静置10 min。已灭菌的6 mm滤纸片放置在培养基上，取10µL样品置于滤纸片上。放置培养箱中37℃培养24 h，测量其抑菌直径，平行测定3次。

3 结果与分析

3.1 薰衣草精油纳米乳制备

3.1.1 表面活性剂的选择

结果表明，Tween-80不可与精油形成纳米乳，故不宜选用；EL-40在表面活性剂与精油质量比在9：1～7：3可形成纳米乳，6：4～1：9不可形成纳米乳；CO-40表面活性剂与精油质量比在9：1～6：4可形成纳米乳，5：5～1：9不可形成纳米乳。通过绘制伪三元相图分析，如图1所示，与EL-40形成的乳区面积相比，CO-40作为表面活性剂时所形成的纳米乳区域面积更大。因此，可选择CO-40作为表面活性剂进行以下实验。

图1 EL-40与CO-40制备薰衣草精油纳米乳的伪三元相图Fig.1 Pseudo ternary phase diagram of lavender essential oil nanoemulsion prepared by EL-40 and CO-40

3.1.2 助表面活性剂的选择

在纳米乳中添加助表面活性剂可使形成的乳液更稳定。结果表明，以无水乙醇为助表面活性剂时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～7：3可形成纳米乳，6：4～1：9不可形成纳米乳；以1，2-丙二醇为助表面活性剂时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～7：3可形成纳米乳，6：4～1：9不可形成纳米乳；以甘油为助表面活性剂时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～8：2可形成纳米乳，7：3～1：9不可形成纳米乳；以PEG-400为助表面活性剂时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～6：4可形成纳米乳，5：5～1：9不可形成纳米乳。通过绘制伪三元相图分析，如图2所示，与无水乙醇、1，2-丙二醇和甘油形成的乳区面积相比，PEG-400作为助表面活性剂时所形成的纳米乳区域面积更大。因此，选择PEG-400作为纳米乳的助表面活性剂。

图2 不同助表面活性剂制备薰衣草精油纳米乳的伪三元相图Fig.2 Pseudo-ternary phase diagrams of lavender essential oil nanoemulsions prepared with different co-surfactants

3.1.3 Km值的确定

Km值结果表明，当Km为2：1时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～7：3可形成纳米乳，6：4～1：9不可形成纳米乳；Km为3：1时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～6：4可形成纳米乳，5：5～1：9不可形成纳米乳；Km为4：1时，混合表面活性剂与精油质量比为9：1～8：2可形成纳米乳，7：3～1：9不可形成纳米乳。通过绘制伪三元相图分析，如图3所示，与Km为2：1和4：1形成的乳区面积相比，Km为3：1时所形成的纳米乳区域面积更大。因此，选择Km为3：1作为表面活性剂与助表面活性剂质量比。

图3 Km为2：1、3：1和4：1制备薰衣草精油纳米乳的伪三元相图Fig.3 Pseudo ternary phase diagrams of lavender essential oil nanoemulsions prepared with Kmof 2：1，3：1 and 4：1

3.1.4 薰衣草精油纳米乳配方的优化

结果表明，混合乳化剂与薰衣草油质量比为9：1、8：2、7：3、6：4时，形成澄清透明的纳米乳。但由表1可知，当混合乳化剂与薰衣草精油质量为6：4、7：3时形成的薰衣草油纳米乳澄清度和稳定性相对较差；另考虑尽量减少表面活性剂用量和提高载药量，故选择混合乳化剂与薰衣草精油质量比为8：2。

表1 薰衣草精油纳米乳稀释后外观性质情况Tab.1 Appearance and properties of lavender essential oil na‑noemulsion after dilution

综合前面筛选的结果，可以确定薰衣草精油纳米乳最佳配方为：表面活性剂CO-40 20.91%、助表面活性剂PEG-400 6.97%、薰衣草精油6.97%和蒸馏水65.15%。

按上述配方和制备方法制备的薰衣草精油纳米乳澄清、透明、流动性好，无分层现象。

3.2 薰衣草纳米乳的质量评价

3.2.1 乳剂类型的判别

根据染料苏丹红和亚甲基兰在纳米乳中的扩散快慢进行判别，结果显示，纳米乳中蓝色扩散速度快，则该纳米乳为水包油O/W型。

3.2.2 pH值

结果表明，薰衣草纳米乳pH值为5.47±0.03。

3.2.3 粒径分布及多分散系数

激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径电位大小及分布，结果如图4-5所示，纳米乳平均粒径为23.79±0.30 nm，多分散系数为0.443±0.12，电位为-2.68±0.37 mV，呈正态分布。本实验纳米乳粒径大小在10～100 nm范围内，大小符合要求，分散系数良好。

图4 薰衣草精油纳米乳的粒径分布图Fig.4 The particle size distribution of lavender essential oil nanoemulsion

3.2.4 微观形态观察

将薰衣草纳米乳置于透射电子显微镜下观察，结果如图6所示，薰衣草精油纳米乳呈球形，分布均匀，分散性良好。

图6 薰衣草精油纳米乳的透射电镜图Fig.6 Transmission electron micrograph of lavender essential oil nanoemulsion

3.3 纳米乳中薰衣草精油含量的测定

3.3.1 紫外检测波长的选择

薰衣草精油在231 nm附近有最大吸收峰，因此选择231 nm作为波长进行以下测定。

3.3.2 含量测定

根据所配浓度梯度对照品测定结果，以吸光度（A）为纵坐标、薰衣草精油浓度（C）为横坐标（mg/mL），绘制标准曲线并拟合回归方程：A=4.95C-0.126 2（R2=0.993 7）。计算可得纳米乳中薰衣草精油含量为53.95±1.12 mg/mL。

3.4 薰衣草精油纳米乳抑菌活性

抑菌效果由表2可知，薰衣草精油和薰衣草精油纳米乳对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有不同程度的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果更佳，且薰衣草精油纳米乳的抑菌效果比薰衣草精油更显著，抑菌圈直径分别为13.67±0.33 mm和9.75±0.20 mm，约1.4倍。对大肠杆菌抑制效果次之，薰衣草精油纳米乳和薰衣草精油对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为11.87±0.13 mm和8.93±0.16mm，约1.3倍。结果表明，将薰衣草精油制备成纳米乳，可以提高抑菌效果。造成这种现象的原因可能是纳米乳中的小脂质颗粒能够促进精油与细胞膜紧密接触，精油中的疏水分子能够破坏细胞膜，导致细菌死亡；而纯精油由于水溶性较低不易与细胞膜接触，从而抑制其相互作用，导致抑制细菌能力下降［21-22］。

图5 薰衣草精油纳米乳的电位分布图Fig.5 Potential distribution diagram of lavender essential oil nanoemulsion

表2 薰衣草精油和精油纳米乳抑菌结果Tab.2 Antibacterial results of lavender essential oil and essen‑tial oil nanoemulsion

4 讨论

纳米乳又称微乳，是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等按适当比例形成的，其乳滴多为球型，大小比较均匀，透明或半透明，因此辅料的选择和配比极为重要。本试验以薰衣草精油为油相，采用形成乳区面积最大的CO-40和PEG-400作为表面活性剂和助表面活性剂，结合伪三相图法筛选辅料用量少、载药量大的纳米乳配方，最终确定制备精油纳米乳的最优配方为表面活性剂CO-40 20.91%、助表面活性剂PEG-400 6.97%、薰衣草精油6.97%和蒸馏水65.15%。所制备的纳米乳澄清、透明、稳定性好，平均粒径为23.79±0.30 nm，多分散系数为0.443±0.12，透射电镜观察纳米乳呈球形，分布均匀，分散性良好。

植物精油也是一种天然的抑菌剂，薰衣草精油中所含的芳樟醇、薰衣草醇和樟脑等对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等的生长均有抑制作用［23-25］。本研究成功研制了薰衣草精油纳米乳，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为受试菌进行抑菌活性研究，试验证明薰衣草精油纳米乳对受试菌均有较好的抑制作用，且较薰衣草精油抑菌效果更强。本试验制备的纳米乳工艺简单、材料安全，有效解决了薰衣草精油的溶解度差、易挥发等问题，增强了抑菌作用，为今后薰衣草精油在化妆品或其他领域中的应用提供了依据和参考，但其具体机理或对其他菌种的抑菌效果还有待进一步研究验证。