基于代谢组学的南方菟丝子和金灯藤质量比较研究

韩 颖，徐金娣，孔 铭，朱 贺，周姗姗，周桂荣，李松林，毛 茜*

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院/中国中医科学院江苏分院中药代谢组研究室，江苏 南京 210028；3.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

菟丝子始载于《神农本草经》，被列为上品，其性甘、温，归肾、肝、经，具有滋补肾肝、固精缩尿、安胎、明目、止泻之功效［1］。临床用于治疗肝肾不足，腰膝酸软，阳痿遗精等症。2020版《中国药典》中规定菟丝子的法定基原为南方菟丝子（Cuscuta austra⁃lisR.Br.）或菟丝子（Cuscuta chinensisLam.）的干燥成熟种子。除药典的收载品种外，同属植物金灯藤（Cuscuta japonicaChoisy）的成熟干燥种子也作为菟丝子在我国南方地区使用［2-3］，并收载于《四川省中药材标准》和《湖南省中药材标准》［4-5］中。现代植化研究表明，南方菟丝子和菟丝子中含有黄酮类、有机酸类等化合物［6-8］，而金灯藤中含有丰富的有机酸［9］。相关文献表明菟丝子具有保肝活性、抗骨质疏松、免疫［6］等作用，金灯藤具有改善学习和记忆［10］、抑制黑色素形成［11］、抗流感病毒［12］等作用。然而，当前对菟丝子和其地方习用品种金灯藤缺少系统的化学成分比较研究。药典以金丝桃苷的含量作为菟丝子的质控指标，难以对不同基原的菟丝子进行全面的质量评价；同时菟丝子的法定品种及金灯藤还缺乏系统的全成分表征研究。

代谢组学能全面表征动植物组织的次生代谢物轮廓，结合多变量数据统计分析，可快速发现样本之间的差异代谢物，目前已广泛运用于不同基原中药材的鉴别［13-15］。本研究采用基于UPLC-QTOFMS/MS的代谢组学策略并整合定量分析方法，对购于全国主要药材市场的45批2个基原的菟丝子药材—南方菟丝子和金灯藤的小分子化学轮廓进行比较研究，以期为菟丝子药材的质量检控和菟丝子药材资源的综合利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与材料

液质联用仪（QTOF SYNAPT G2-S，美国Wa‑ters公司），工作站（Empower，美国Waters公司）；高效液相色谱仪-紫外检测器（2695-2996、美国Wa‑ters公司）；超纯水制备仪（Milli-Q，美国Millipore公司）；粉碎机（FW100，天津市泰斯特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9053A型，上海精宏实验设备有限公司）；十万分之一电子天平（AT201，瑞士METTLER公司）；超声波清洗器（KQ-250E，昆山超声仪器有限公司）。

咖 啡 酸（批 号20110501）、山 奈 酚（批 号20082105）、芦丁（批号18122901）购于成都普菲德生物技术有限公司。金丝桃苷（批号70102）、紫云英苷（批号72622）、异槲皮苷（批号32142）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（批号88488）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号95976）、绿原酸（批号M60618068）均购于上海科维化学技术有限公司；以上对照品纯度≥98%。乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲醇（色谱级，江苏汉邦科技有限公司）；甲酸（质谱级，德国Sigma-Aldrich公司），其余试剂均为分析纯。实验用水为Millipore超纯水。

1.2 药材收集

市售45批菟丝子药材分别于2018年和2020年购于全国主流药材市场，每批次不少于50 g。全部样品经江苏省中医药研究院李松林研究员依据2020年版《中国药典》及文献［16-17］鉴别为南方菟丝子（C.australis）和金灯藤（C.japonica）的干燥成熟种子。具体信息见表1。

表1 菟丝子商品收集情况Tab.1 Collection information of Cuscutae Semen

2 方法

2.1 UPLC-QTOF-MS/MS样品制备及分析条件

2.1.1 对照品溶液制备

精密称定绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、异槲皮苷、山奈酚、芦丁对照品各1 mg，加1 mL甲醇分别制备成1 mg/mL的对照品溶液。再各取100µL对照品溶液，加甲醇补足至1 mL，依次逐级稀释成1µg/mL的对照品溶液，用于进样。

2.1.2 供试品溶液制备

精密称定过30目筛子的菟丝子粉末0.2 g，加入8 mL 80%甲醇于具塞试管中，超声（功率为250 W，频率40 kHz）提取1 h，用80%甲醇补足损失的质量。离心（13 000 r/min、10 min），保存上清液，备用。取上清液20µL稀释至1 mL，0.45µm微孔滤膜滤过后进样。每批药材平行制备3份样品。

2.1.3 UPLC-QTOF-MS/MS分析

色谱条件：Waters ACQUITY UPLCTM系统（美国Waters公司）；色谱柱：BEH C18柱（2.1×100 mm内径，1.7µm）；柱温：35℃；进样量：2µL；流动相：0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；洗脱条件：0～1 min，95～95%A；1～2min，95～85%A；2～7 min，85～55%A；7～12 min，55%～5%A；12～14 min，5～5%A；14～15 min，5%～95%A，15～17 min，95%～95%A。质谱条件：Wa‑ters Synapt G2-SQ-TOF质谱仪（美国Waters公司）电喷雾离子源，正负离子模式；毛细管电压：2.5 KV；锥孔电压：20 V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气体流速：800 L/h；质量扫描范围为：m/z50～1 200 Da；扫描时间：0.5 s。采用MassLynx 4.1软件（版本4.1，美国Waters公司）进行采集，参考相关文献［5］，建立包括化合物名称、分子式、分子量、化学结构和相关参考文献的菟丝子化合物数据库，结合对照品和质量精度小于5 ppm的经验分子式比对两种方法，进行小分子化合物的全成分表征。使用Progenesis QI软件（版本2.3，美国Waters公司）进行峰提取、峰匹配及归一化等处理，信息导入EZinfo 3.0软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。

2.2 特征性成分定量分析

2.2.1 对照品溶液制备

取绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山奈酚、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，用80%甲醇溶解，用倍半稀释法制成绿原酸292.50µg/mL、咖啡酸38.44µg/mL、金丝桃苷127.50µg/mL、异槲皮苷40.63µg/mL、紫云英苷74.38µg/mL、山奈酚32.19µg/mL、3，4-二咖啡酰奎宁酸74.69µg/mL和4，5-二咖啡酰奎宁酸64.38µg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

精密移取2.1.2项下上清液1mL，离心（13000r/min、10 min），0.45µm微孔滤膜滤过后进样。

2.2.3 色谱条件

色谱 柱：Alltima TM C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；柱温：30℃；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；进样量：10µL。洗脱梯度：洗脱条件：0～16 min，15～15%A；16～23 min，15～23%A；23～30 min，23%～23%A；30～35 min，23～28%A；35～38 min，28%～35%A；38～58 min，35～95%A；58～60 min，95%～15%A；60～70 min，15%～15%A。

2.3 方法学验证

线性关系与灵敏度：分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，分别按适当的比例加甲醇稀释成至少6个不同浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，以各对照品的质量浓度为横坐标（X），各对照品的峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线评价方法的线性；以检测限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantitation，LOQ）评价灵敏度。（LOD：S/N=3和LOQ：S/N=10）。8种成分在线性范围内显示良好的线性（R2＞0.999），见表3。

表3 HPLC-PDA定量方法学验证Tab.3 Validation of HPLC-PDA

精密度：精密称取南方菟丝子（JSPACM-67-38）和金灯藤粉末（JSPACM-67-2），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。日内精密度：于一天内连续进样该供试品溶液6次，记录峰面积，计算RSD值。日间精密度：供试品溶液连续测定3天，每天重复测定3次，记录峰面积，计算RSD值。经计算，8种成分日内和日间精密度RSD分别不超过3.27%、3.63%。

稳定性：精密称取南方菟丝子（JSPACM-67-38）和金灯藤粉末（JSPACM-67-2），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定，计算峰面积的RSD值。稳定性RSD均不超过3.73%，表明方法重复性良好。

重复性：精密称取同一批次药材粉末6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算RSD值。8种成分质量分数的RSD均不超过3.18%。

加样回收率：精密称取已测定各成分含量的菟丝子粉末9份（JSPACM-67-38和JSPACM-67-2），分别加入50%、100%、150%量的各对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。8种成分的加样回收率在100.8～104.7%。

3 结果与分析

3.1 南方菟丝子和金灯藤的全成分表征

分别比较了两个基原样品在正负离子下的基峰离子流图（Base peak intensity，BPI），发现在负离子模式下，可获得较强的化合物响应和更为丰富的化合物信息，故采用负离子模式进行检测。南方菟丝子、金灯藤及对照品BPI图如图1所示。依据化合物的精确分子量、碎片离子，结合对照品标准图谱及自建化学成分数据库，从南方菟丝子中共鉴定到13种成分，包括11个类黄酮和2个有机酸。11个黄酮类成分分别为咖啡酰-二糖苷、6-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷、Lignan-O-coumaroylglucoside、槲皮素-3-O-半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷、Coumaroyl caffeoylgly‑coside、槲皮素-3-O-芹菜糖-（1→2）-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚。2个有机酸类成分为3，5-二咖啡酰奎宁酸的同分异构体和绿原酸。金灯藤中共鉴定到13种成分，包括6个黄酮和7个有机酸。其中6个黄酮类成分分别为咖啡酰-二糖苷、6-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷、咖啡酰-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芹菜糖-（1→2）-己糖苷、芦丁、山奈酚。7个有机酸类成分分别为绿原酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、香豆酮-咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸及4，5-二咖啡酰奎宁酸。

图1 对照品（A）、南方菟丝子（B）和金灯藤（C）醇提液在负离子模式下的BPI图Fig.1 BPIchromatogramsof reference substance（A），C.australis（B）and C.japonica（C）in negative ion mode

3.2 特征性成分的筛选和鉴定

将数据导入Progenesis QI进行峰提取及归一化等处理后运用EZinfo 3.0软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），比较2个基原菟丝子样品的整体质量差异。再通过正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares dis‑crimination analysis，OPLS-DA）的VIP-plot和SPLOT筛选特征性差异成分。PCA分析结果如图2（A）所示，南方菟丝子和金灯藤可明显聚为2大类，说明其小分子次生代谢产物化学轮廓存在明显差异。采用OPLS-DA进行分析，如图2（B）、（C）和（D）所示，选用VIP值>2以及S-PLOT中远离原点（P（corr）［1］>0.4或者P（corr）［1］<-0.4）为筛选条件，根据保留时间、准分子离子峰、加和离子峰和特征碎片离子峰与对照品数据比对，筛选鉴定出8个特征性差异化合物，离子强度在各批次样本中的Trend-plot如图3所示。化合物信息见表2。

图3 8个特征标志物的trends-plot图Fig.3 The trends-plot of eight characteristic markers

表2 南方菟丝子和金灯藤化学成分鉴定结果Tab.2 Components identified from C.australis and C.japonica

图2 南方菟丝子和金灯藤在负离子模式下的PCA图（A）、OPLS-DA图（B）、S-plot图（C）和Conefficients-VIP图（D）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），S-plot（C）and Conefficients-VIPscore plot（D）of C.australis and C.ja⁃ponica in negative ion mode

续表

3.3 8个特征性差异成分的定量分析

南方菟丝子和金灯藤的色谱图见图4。34批南方菟丝子中金丝桃苷、紫云英苷、异槲皮苷和山奈酚的平均含量为2289.28、810.73、395.95、159.40µg/g；绿原酸平均含量为2 102.84µg/g。11批金灯藤中有机酸类成分含量较高，绿原酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸的平均含量分别为3 512.07、1 213.15、994.32、112.22µg/g。而三种黄酮类成分含量较低：异槲皮苷、金丝桃苷、山奈酚的平均含量分别为144.35、97.68、25.53µg/g。如图5所示，南方菟丝子中特征性黄酮的总含量为金灯藤的21.5倍，金灯藤中特征性有机酸的总含量为南方菟丝子的2.8倍。在2020版《中国药典》中，规定菟丝子的质控指标—金丝桃苷含量标准为“按干燥品计算，含金丝桃苷（C21H20O12）不得少于0.1%”。本研究中，金丝桃苷在南方菟丝子中平均含量为0.15%～0.38%，而金灯藤中平均含量仅为0.009 5%～0.010 0%（均未达药典标准），南方菟丝子中金丝桃苷的平均含量为金灯藤的23.4倍。

图4 混合对照品和2种基原菟丝子小分子HPLC-PAD图Fig.4 HPLC-PADchromatograms of reference substance（A），small molecules in C.australis（B）and C.japonica（C）

图5 8种差异性成分含量测定结果Fig.5 Contents determination results of 8 characteristic markers in C.australis and C.japonica

4 讨论与结论

调查表明，南方菟丝子药材蕴藏量大，是菟丝子药材市场的主流品种［3］。现代植化研究表明南方菟丝子富含黄酮类成分［2，6］，而金灯藤含有丰富的有机酸成分［9］，但目前尚未有对南方菟丝子和金灯藤的化学轮廓、特征性成分及其含量进行系统比较研究的报道。同时，金灯藤的物质基础与南方菟丝子是否相似，其作为南方菟丝子的替代品种是否合理仍然是亟待解决的科学问题。

本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS的代谢组学策略研究发现：南方菟丝子和金灯藤的次生代谢产物化学轮廓有明显的差异。结合定性分析和多变量数据统计结果，筛选、鉴定到南方菟丝子的4种特征性成分：山奈酚、异槲皮苷、紫云英苷和金丝桃苷；金灯藤的4种特征性成分：咖啡酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸和绿原酸。定量分析结果更进一步表明南方菟丝子中黄酮类成分的平均含量约为金灯藤21.5倍，而金灯藤中有机酸平均含量是南方菟丝子的2.8倍。2020版药典规定菟丝子中金丝桃苷含量不得低于0.10%［1］，本研究中34批南方菟丝子中金丝桃苷含量均达到2020版药典标准，11批金灯藤中金丝桃苷的含量均未达到药典标准，可见金灯藤的化学成分在种类和含量上都与南方菟丝子存在明显的差异。在药理研究中，南方菟丝子的黄酮类成分具有改善肾虚模型大鼠的相关作用及保肝、抗骨质疏松、调节免疫等活性［6，18-19］。而金灯藤中的有机酸类成分［20］，如咖啡酸具有抗氧化、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒等药理作用［21］；绿原酸具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤［22-23］等活性。两者主要成分的药理作用也存在较大差异。

综上所述，本研究发现南方菟丝子和金灯藤在化学轮廓、特征性成分及其含量上存在显著差异。且文献报道过的两个基原药材的主要成分的药理作用也各不同。因此，金灯藤作为我国药典中菟丝子法定品种的替代品种使用的合理性仍需药效学等更进一步的研究。