不同品种及产地鲜天麻挥发性物质差异性分析

孙海燕 郝丹青 李新生,2 金文刚

(1. 陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2. 陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；3. 国家农产品保鲜工程技术研究中心秦巴地区保鲜工作站，陕西 汉中 723000；4. 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723000；5. 陕西理工大学秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室〔培育〕，陕西 汉中 723000)

天麻又名定风草、神草、赤箭、独摇芝等，在中国云南、贵州、陕西、湖北、四川等地被广泛栽培[1-2]。2020年1月2日，国家卫健委、国家市场监督管理总局发布《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》中，将天麻、党参等9种物质列入药食同源物质生产经营试点中，这一决定有望刺激和带动中国天麻产业的快速发展，尤其鲜天麻的相关研究。

鲜天麻自身具有特殊的香味，不同品种、采收期的天麻香气浓郁程度有所区别。目前测定天麻中挥发性香气物质成分普遍采用电子鼻、气质色谱—质谱联用技术等。气相—离子迁移色谱(GC-IMS)法结合了气相色谱高分离度和离子迁移谱高灵敏度的优势，无需任何特殊的样品前处理，即可快速检测样品中的痕量挥发性有机物[3]，该仪器已被广泛应用于食品风味分析[4-5]、真伪鉴别[6-7]和新鲜度分析[8]中，也可用于非法药物的痕量检测[9]及人呼出气体挥发性有机化合物[10-11]和人类皮肤释放挥发性化合物[12-13]的监测和疾病判别[14-15]中等。但在鲜天麻挥发性物质测定中未见气相色谱—离子迁移谱联用(GC-IMS)技术的相关研究报道。研究拟利用GC-IMS技术对6个产地、3个品种的鲜天麻挥发性物质成分进行测定分析，以期为后续鲜天麻的快速分类区分提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料

天麻(如表1所示)：采收时间集中在11～12月份，种植时间约10个月。当天采挖后，低温迅速邮寄实验室进行挥发性物质测定。

表1 天麻品种产地Table 1 Variety and origin of Gastrodia elata

1.1.2 仪器

气相色谱—离子迁移色谱：FlvourSpec型，德国GAS公司。

1.2 样品处理

取新鲜天麻，洗去表面泥沙与附着的蜜环菌，切成尽量小的碎末，取7 g天麻样品，置于20 mL顶空进样瓶中密封，顶空进样。每种样品重复测定3次。

1.3 GC-IMS条件

1.3.1 气相—离子迁移谱单元 分析时间20 min，色谱柱类型MXT-5，15 mL，0.53 mm内径(ID)，1 μm膜厚(FT)，柱温60 ℃，IMS温度45 ℃，载气/漂移气为N2。

1.3.2 自动顶空进样单元 孵育温度60 ℃，孵育时间15 min 后进样，进样体积500 μL，进样针温度85 ℃，孵化转速500 r/min。

1.3.3 气相色谱条件 如表2所示。

表2 气相色谱条件[15]Table 2 Chromatographic conditions

1.4 数据处理

利用仪器配套的分析软件，包括VOCal和Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA三款插件及“最近邻”指纹分析，分别从不同角度进行样品分析。

2 结果与分析

2.1 样品中挥发性物质成分对比

利用Reporter插件制作鲜天麻中挥发性有机物质的二维俯视图(见图1)，红色的RIP峰两边不同颜色的小点代表检测到的不同的挥发性有机物。不同颜色代表鲜天麻中检测到的不同挥发性物质的浓度不同，其中白色表示检测到的挥发性物质浓度较低，红色表示检测到的挥发性物质浓度较高，而且颜色越深表示该挥发性物质的浓度越大。其背景颜色为蓝色，横坐标1.0处的红色竖线即为图1中的RIP峰(反应离子峰，经归一化处理)，根据峰两侧点的颜色有无或者深浅可以阐明不同鲜天麻样品之间的挥发性物质组分及浓度的差异。

由图1和图2可以看出，乌天麻所含挥发性物质种类和浓度明显比红天麻多，而相同品种之间鲜天麻的挥发性物质种类和浓度之间相差不大。说明天麻品种对挥发性物质的检测结果起主要作用，而且乌天麻的挥发性物质种类和浓度较红天麻多和高，也从侧面说明乌天麻品质更优。

图1 鲜天麻中挥发性有机物的成分谱图Figure 1 Spectrum of volatile components in fresh Gastrodia elata BI

图2 鲜天麻中挥发性有机物的成分对比差异图谱Figure 2 Comparative difference spectrum of volatile components in fresh Gastrodia elata BI

2.2 鲜天麻中挥发性物质Gallery Plot指纹谱图

绘制不同鲜天麻样品的Gallery Plot指纹图谱，如图3 所示。

横行代表一个鲜天麻样品中的不同挥发性物质成分；竖列代表检测到的某种挥发性物质在不同鲜天麻样品中的信号峰强度；每一个信号峰的颜色明暗代表该物质的浓度高低，红色代表该挥发性物质含量较高，白色代表含量低；数字表示未知物图3 鲜天麻的Gallery Plot指纹图谱Figure 3 Gallery plot fingerprint of fresh Gastrodia elata BI

由图3可以看出，3种乌天麻所含挥发性物质种类和含量均明显高于红天麻和杂交天麻，其中T3云南乌天麻中苯甲醛、苯乙醛、丙烯酸正丁酯、正己醇、异戊酸、丙酸和苯乙稀含量最高，比较典型特色的挥发性物质为丙烯酸正丁酯、丙酸和未知物24，这3种挥发性物质在其他鲜天麻中基本检测不到，即便在T2贵州乌天麻中有检出，但检测到的浓度极低；T7湖北乌天麻中反式E-2-己烯醛、E-2-辛烯醛、E-2-庚烯醛、己醛、异戊酸甲酯、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、1-戊醇和2-正戊基呋喃等物质含量最高，比较典型特色的挥发性物质为(E)-2-庚烯醛；T1贵州红天麻中挥发性物质种类和浓度均优于其他红天麻，其中庚醛、辛醛、壬醛、己醛、乙酸乙酯、甲酸乙酯、异丙醇、丁醇和己酸等物质含量最高；T2贵州乌天麻中比较典型的挥发性物质为未知物1、2和25；T4湖北红天麻中相对典型的物质为4-甲基-2-戊酮；T8甘肃红天麻样品中的典型香气物质为β-蒎烯，甘肃红天麻中含量最高，在T4湖北红天麻和T5商洛杂交天麻样品中也含有，但含量非常低，而在其他鲜天麻样品中未检测到；在T6汉中红天麻中也检测到了其特有的挥发性物质，即未知物16，该挥发性物质仅在汉中红天麻中存在，而在其他鲜天麻中未检测到。

2.3 主成分分析

降维后进行主成分分析，其结果见图4。不同颜色代表不同产地或品种的鲜天麻，不同点的远近代表相似性高低，相同点的离散程度代表相同样品的均一性。由图4可知，红天麻和乌天麻之间各自具有一定聚集区域，说明两个品种鲜天麻之间的特征差异较为明显。而相同品种不同产地的样本之间的特征差异也比较明显，平行测试聚集更为紧密，而样本间的距离较远。

图4 样品PCA分析Figure 4 PCA analysis

由图4还可以看出，第一主成分贡献率35%，第二主成分贡献率24%，第一、二主成分总贡献率59%。T2贵州乌天麻、T3云南乌天麻和T7湖北乌天麻分散在一侧，说明3种乌天麻具有相似性，且T2贵州乌天麻和T3云南乌天麻聚集度较高，说明这两个产地采集的天麻相似性更好，且3个产地鲜天麻的均一性均较好。T1贵州红天麻、T4湖北红天麻、T5商洛杂交天麻、T6汉中红天麻和T8甘肃红天麻聚集度较好，说明相似性较高，而T5商洛杂交天麻介于T6汉中红天麻和T8甘肃红天麻之间，且与T8甘肃红天麻相似性更高，说明T5商洛杂交天麻的品性更接近红天麻，而与乌天麻相似性较差。不同产地的鲜天麻，其聚集比较分散，而相同品种的鲜天麻聚集性更高，说明影响聚类的主要因素是鲜天麻品种，而地域不是影响鲜天麻香气的主因。

2.4 聚类分析

样品间欧氏距离图见图5。通过欧式距离，可以更直接对所有样本进行辨别区分，可以看出T2贵州乌天麻和T3云南乌天麻之间以及T6汉中红天麻和T8甘肃红天麻之间的距离较近，相似度高，而T5商洛杂交天麻与T6汉中红天麻和T8甘肃红天麻之间相似度均较高。也进一步证实T2贵州乌天麻和T3云南乌天麻相似性更高，T6汉中红天麻和T8甘肃红天麻相似性更高；T5商洛杂交天麻与红天麻相似性较乌天麻而言更高。这与主成分分析结果一致。其原因可能是：① 两个地域的相同品种天麻本身就很接近；② 当地种植的天麻购于另一个地方，由于种植环境、海拔等的不同，导致天麻香气有所差异，但差异不大，因此不同地域同一个品种鲜天麻的相似性较高。

图5 样品间欧氏距离图Figure 5 Euclidean distance graph

2.5 鲜天麻中挥发性有机物定性分析

由图6可以看出，鲜天麻中共检测到75种挥发性物质及其具体分布的相应位置，其中点越大、越红说明相应的挥发性物质浓度越高，即(E)-2-庚烯醛-M、苯甲醛、苯乙醛、戊醛-D、(E)-2-庚烯醛、正己醛-D、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯-M、异丙醇-D和甲酸乙酯-D是鲜天麻中最主要的挥发性物质成分。

图6 Library Search定性分析Figure 6 Qualitative analysis

由表3可以看出，鲜天麻中共检出75种挥发性化合物，其中可以鉴定出的物质有45种，其中，醛类物质检出数量最多，共16种，占所有已知物质的35.6%；其次是酯类，共9种，占所有已知物质的20%，与醛类物质总和超50%；醇类6种；酮类检出5种；酸类物质检出3种，未知化合物共检出有30种，曹森等[16]利用电子鼻和GC-MS对贵州毕节乌天麻的芳香品质进行测定，发现烷烃类、芳香成分、硫化物和菇烯类对天麻香气的贡献率较大，可达81.42%；利用GC-MS对3个不同采收时间的天麻香气成分进行鉴定，其中第一采收期的天麻香气成分总数为40种，第二采收期的42种，第三采收期的36种，总香气成分65种，其中共有成分19种，主要为醇类、酯类、酮类、酸类、醛类、酚类、烷烃类等；测定的香气种类类型与试验结果类似，但测定检出的天麻中挥发性物质数量要比试验少10种。黄名正等[17]以贵州天麻干燥块茎为试材，利用超临界CO2萃取天麻中挥发性成分，结合GC-MS进行定量分析，结果发现，天麻油中共分离鉴定出30种挥发性成分，主要为醛类、酚类、酯类、植醇类、有机酸类、烷烃和烯烃类等，尤以有机酸类占比最大；虽然测定的挥发性物质类型比试验多，但得到的天麻挥发性成分数量要少50%以上，可能与试验材料有关。采用不同的仪器对天麻挥发性成分进行分析测定，影响因素除与天麻材料本身有关外，也与所选仪器有很大关系，其中电子鼻测定的是大的挥发性物质种类，而不能测定分析出具体是哪种物质；GC-MS是全范围测定，易挥发性物质、半挥发性物质和难挥发性物质均可测定，而GC-IMS主要测定易挥发性物质，而且检测的限值较GC-MS更低，更灵敏，可以捕捉检测到更多痕量有机物，在试验测定时，需要根据实际情况具体选择，也可多仪器结合测定，结果更全面。在该试验中有近50%的物质数据库中无法检测到，后期需要结合质谱、核磁共振等测定结果进一步分析其化学结构，从而确定其具体物质名称。

表3 鲜天麻中挥发性化合物定性分析列表Table 3 Qualitative analysis of volatile compounds in fresh Gastrodia elata BI

3 结论

(1) 红天麻和乌天麻之间的特征差异比产地之间更为明显，说明通过挥发性物质成分的测定可以区别鲜天麻的品种，因此该方法更适合进行鲜天麻品种的区分鉴定，而不适用于产地之间的区分。

(2) 商洛乌红杂交天麻与甘肃红天麻之间相似度最高，而与乌天麻相似性较差。

(3) 该方法能够定性出鲜天麻中的75种挥发性化学物质，其中醛类物质检出数量最多，共16种，其次为酯类、醇类等，尤以(E)-2-庚烯醛-M、苯甲醛、苯乙醛、戊醛-D、(E)-2-庚烯醛、正己醛-D、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯-M、异丙醇-D和甲酸乙酯-D在鲜天麻中浓度高；有30种未定性物质，还需结合质谱、核磁共振等技术进一步进行分析。