胶体金免疫层析法测定山楂制品中罗丹明B

李倩 杨国伟 张烨

摘 要：目的：建立了胶体金免疫层析法快速检定山楂制品中罗丹明B。方法：本实验通过逐步优化前处理方法，使得最终前处理方法和复溶液能够满足检测需要。确定了提取-净化-浓缩-复溶的过程，将目标物进行了净化和浓缩，通过肉眼观测快速检测卡显色情况和液相色谱检测结果进行比较。结果：胶体金免疫层析法检出的阴性样品、阳性样品（5 ?g·kg-1）、阳性样品（10 ?g·kg-1）均与液相色谱法检测结果一致。结论：该方法可作为山楂制品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测。

关键词：罗丹明B；山楂制品；前处理方法；胶体金免疫层析法

Determination of Rhodamine B in Hawthorn Products by Colloidal Gold-Based Immunochromatography

LI Qian， YANG Guowei， ZHANG Ye

（Shanxi Inspection and Testing Center Institute of Drug Inspection Technology， Taiyuan 030001， China）

Abstract： Objective： A rapid detection method of rhodamine B in hawthorn products is established by colloidal gold-based immunochromatography. Method： In this experiment， the final pretreatment method and complex solution can meet the needs of detection by gradually optimizing the pretreatment method. The process of extraction purification concentration re dissolution was determined. The target was purified and concentrated. The color development of the fast detection card was observed by naked eyes and the results of liquid chromatography were compared. Result： Negative sample， spositive samples（5 μg·kg-1）and spositive samples（10 μg·kg-1） can be detected by colloidal gold immunochromatograph and Hplc. Conclusion： This method can be used as a rapid detection rhodamine B in hawthorn products by colloidal gold immunochromatography.

Keywords： rhodamine B; hawthorn products; pretreatment; colloidal gold immunochromatography

罗丹明B，也叫花粉红，是一种人工合成的脂溶性荧光染料，呈鲜桃红色。通过食物链进入人体后，经过生物转化会产生致癌作用，我国已明确规定禁止其在食品中使用。但由于罗丹明B具有价格低廉、颜色鲜艳、着色稳等特点，某些小作坊为了降低成本仍违法将其添加到食品中。为保障食品安全，需要建立快速、稳定、成本可控的检测方法。罗丹明B最常见的实验室检测方法有高效液相色谱法[1-2]、液相色谱仪质谱/质谱法[3]等，其中色谱法检测食品中罗丹明B具有准确、灵敏度高的优点。但是样品前处理复杂，还需要用到凝胶色谱净化系统、液相、质谱等大型检测设备，准入门槛较高，难以在基层检测部门中开展，目前只能在少部分实验室中使用，也无法实现现场检测。

胶体金免疫层析法具有操作简单、耗时短、特异性强、无需昂贵检测仪器等优点，尤其适合高通量初筛。目前我国市场上已有数家利用此技术的商品化试剂盒，适合在快检中推广使用。因此，本研究选择胶体金免疫层析技术[4-8]作为本方法的主要检测手段。本实验通过优化前处理方法，建立以胶体金免疫层析技术为基础的检测方法，该方法的建立为食品中罗丹明B的现场质量控制提供了依据，同时也为食品样品的大批量初筛提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

移液枪；中佳高速离心机；多管漩涡混合仪；电子天平；固相萃取小柱（中性氧化铝柱，1 000 mg/6 mL）；深圳易瑞免疫胶体金试剂盒；正己烷、丙酮、甲醇、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠均为分析纯。

山楂片（空白样品），山楂条（空白样品），均购自太原本地大型超市，经检测不含罗丹明B。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的制备

称取罗丹明B，加甲醇定容、混匀制得0.1 μg·mL-1的标准溶液。临用新配。

1.2.2 复溶液的配制

①pH=6.8磷酸盐缓冲液。取0.2 mol·L-1磷酸氢二钠溶液25 mL，加0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液11.8 mL，再加水至100 mL，混匀即得。②pH=7.1磷酸盐缓冲液。取0.2 mol·L-1磷酸氢二钠溶液67 mL，加0.2 mol·L-1磷酸二氢钠溶液33 mL，混匀即得。

③pH=7.4磷酸盐缓冲液。磷酸氢二钠1.36 g，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液79 mL，加水至200 mL，混匀即得。

1.2.3 前处理方法

取山楂制品2 g于50 mL具塞离心管中，加15 mL丙酮-正己烷（8∶2），振荡提取3 min，以8 000 r·min-1离心2 min。上清液待净化。将全部的上清液转移至中性氧化铝小柱中，并用15 mL丙酮-正己烷（8∶2）淋洗中性氧化铝小柱，流出液全部弃去。再加入甲醇5 mL洗脱并收集洗脱液，氮气吹干。精密加入500 ?L复溶液，涡旋混合1 min，作为待测液。

2 结果与分析

2.1 实验条件的选择

2.1.1 提取试剂的选择

考察水、磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮-正己烷（8∶2）溶液对罗丹明B的提取效果。结果表明，水溶液的提取系统中水、磷酸盐缓冲液含水量高会影响中性氧化铝小柱的活性，不适用于固相萃取小柱，不利于浓缩和富集。有机相的提取系统中乙醇、甲醇和丙酮属于亲水性有机溶剂，提取样品杂质较多。而丙酮-正己烷（8∶2）溶液具有一定的亲水性又有一定比例的亲脂性对罗丹明B的提取效果较好，且适用于固相萃取。故选择丙酮-正己烷（8∶2）作为提取剂。

2.1.2 洗脱液体积的选择

罗丹明B经固相萃取系统浓缩富集后，需加入甲醇进行洗脱，分别考察1 mL、3 mL、5 mL和10 mL体积的洗脱效率，发现淋洗体积超过5 mL样品的结果趋于稳定。考虑到时效性选择5 mL作为洗脱体积取值。

2.1.3 高效液相色谱法测定固相萃取小柱耐用性

选择市场上不同品牌的中性氧化铝固相萃取小柱（规格：1 g/6 mL），进行耐用性评价，回收率均在60%～120%，说明固相萃取小柱的耐用性良好，见表1。

2.1.4 复溶液的选择

对比pH=6.8磷酸盐缓冲液、pH=7.1磷酸盐缓冲液、pH=7.4磷酸盐缓冲液这3种溶液的点板效果。结果显示pH=7.1磷酸盐缓冲液复溶效果比较好，可以得到满意的点板效果。

2.1.5 测定时间

本研究考察了复溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min测定效果。结果表明，随着时间的延长，待测液点板后T线颜色逐渐变深，不利于结果的真实判定，因此本方法建议复溶后立即测定。

2.1.6 孵育温度

为了考察温度对抗原抗体反应的影响，本研究对比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反应效果。在上述各温度下，30～40 ℃孵育下T线检测结果较明显。因此为了避免极端监测环境对于检测相关各个环节的影响，建议日常检验在室内或相对温和的检验环境中进行，故本方法中孵育温度建议为30～40 ℃。

2.2 结果判定以及测定步骤

2.2.1 结果判定

由图1知，阳性结果：检测线未能显色或颜色较控制线颜色浅，表明样品中罗丹明B检出为阳性。阴性结果：检测线颜色比控制线颜色深或者二者颜色一致，表明样品中罗丹明B未检出为阴性。

2.2.2 结果性能指标计算

取已购空白样品200份，分别加入0 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的罗丹明B，按照步骤进行测定。由表2可知，5 μg·kg-1以上浓度均可以满足要求，可以作为本方法的检出限。

2.3 交叉反应

分别取苏丹红Ⅰ-Ⅳ、诱惑红、胭脂红、罗丹明6G和罗丹明123标准物质，制成水平为20 ng·mL-1的标准溶液，按照本方法进行实验，考察试剂盒与上述化合物的交叉反应。结果表明上述化合物均无交叉反应。

2.4 高液相色谱法测定不同基质的加标测定结果的一致性分析

使用高液相色谱法对20份分别添加0倍、1倍、2倍检出限水平的空白及阳性样品进行检定。由表3知，测试结果表明回收率均满足检测要求（回收率要求在60%～120%），即0 μg·kg-1均未检出为阴性，5 μg·kg-1、10 μg·kg-1均可以检出为阳性，均与本方法表2中的结果保持一致。

3 结论与讨论

本文通过优选提取试剂和复溶溶液，优化了洗脱溶液的洗脱体积，并对常见中性氧化铝小柱进行耐用性评价，同时还考察测定时间、孵育温度对实验的影响，使得单样时间得以控制在1 h之内。实际测定结果表明该方法较传统实验室常用的液相色谱法、液相色谱质谱联用技术、酶联免疫方法操作更加简便快速，回收率符合要求，假阳性率较低，特异性强，成本低，时间较实验室方法大大缩减，非常适合实验室大批量快速筛查以及有一定实验操作基础的基层工作人员现场检测。但要注意到商品化快检试剂盒为本方法应用过程中的关键环节。建议应用试剂盒前对其性能指标进行考察评价，符合方法学性能指标和评价准则各项要求后方可使用。此外，方法使用过程涉及样品前处理和结果判读等关键步骤，如果操作不当将直接影响测定结果。建议对方法使用者进行必要的培训。同时本方法为筛选方法，筛查出的阳性结果应用参比方法对结果进行进一步的确证。

参考文献

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