TIPE2在育龄期女性乳腺癌中的表达及与VEGF的相关性分析

赵志廉，陆玲玲，郭曼，菅凤国，付振鹏，刘明海

(1.山东省昌邑市妇幼保健院 病理科，山东 昌邑 261300；2.山东省昌邑市妇幼保健院 妇产科，山东 昌邑 261300;3.山东省昌邑市妇幼保健院 超声科，山东 昌邑 261300;4.山东省昌邑市妇幼保健院 外科，山东 昌邑 261300;5.山东省潍坊市中医院 病理科，山东 昌邑 261300)

随着科学的发展，我们在癌症研究领域取得了巨大的进展，但是乳腺癌仍然是一个重要的影响女性健康的问题，是当前医学研究需要攻克的难题。在全球，乳腺癌是影响女性身心健康的最常见的癌症，其发病率和死亡率预计在未来几年将显著增加。目前的研究显示，在45 岁以下的年轻女性中，乳腺癌是癌症导致死亡的主要原因。乳腺癌在年轻女性患者人群中尤其具有复杂的生物学特征。对于绝经期前的育龄期女性，乳腺癌会带来更高的风险，因为它通常更具侵袭性和复发行为，预后会更差。与年长者乳腺癌病人相比，育龄期女性患者的TNM 分期更晚，肿瘤更具侵袭性，并且具有比较特殊的分子表型。然而现有的诊断和治疗方法未将育龄期女性这一特殊人群单独划分。我们更要加强宣传教育，加大育龄期女性对乳腺癌的重视，做到早期发现、早期诊断，提高育龄期女性乳腺癌患者的生存质量。近几年更多的研究针对育龄期女性的乳腺癌的分子标记物和发病机制。

肿瘤坏死因子-α- 诱导蛋白8(TNFAIP8)是近几年发现的一组蛋白,又称TIPE。 该家族有TNFAIP8，TIPE1(TNFAIP8L1)，TIPE2(TNFAIP8L2)和 TIPE3(TNFAIP8L3)。TIPE2 定位于人1 号染色体(1q21.2-1q21.3)。人TIPE2 可以表达于多种非免疫细胞中，提示TIPE2 不仅参与免疫调节,维持机体的免疫平衡，TIPE2 在一些肿瘤发生发展过程中还可能作为抑癌基因。最近研究发现，TIPE2 在胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌等肿瘤组织中的表达明显降低。并且与肿瘤的侵袭性、转移等恶性生物学行为呈负相关,提示TIPE2 抑制了这些肿瘤的发生发展过程。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种分子量约为45kda 的同二聚糖蛋白。VEGF 在血管的生成过程中作用重大，与血管内皮细胞上表达的两种VEGF 受体(VEGF受体1 和VEGF 受体2)结合。在正常人体发育中，VEGF 在胚胎发育过程中参与了血管的生成，并参与成人伤口愈合的过程。文献报道VEGF 是肿瘤血管生成的关键介质，它在肿瘤中的表达受癌基因、多种生长因子及缺氧等因素的上调。研究显示VEGF 在非小细胞肺癌、胰腺癌等肿瘤组织中表达显著升高，并且在体内外实验中发现，VEGF 在癌症中的发生发展不只是参与肿瘤新生血管的形成，还有其特定的生物学作用。

本实验通过免疫组织化学的方法评估TIPE2，VEGF在育龄期女性乳腺癌组织中的表达异常情况，研究其与淋巴结转移、组织学分级等临床病理因素的关系，并探讨TIPE2 与VEGF 的相关性。为临床研究育龄期女性乳腺癌的发展提供可靠的实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

选取昌邑市妇幼保健院病理科2012年1月至2017年12月术前未行任何治疗的乳腺浸润性导管癌标本110 例作为实验组，均为育龄期女性(15～49)，年龄21～49 岁，平均年龄37 岁。术后病理诊断均为浸润性导管癌，临床病理资料完整，同时随机选取40 例实验组的距离癌旁1 cm 的正常乳腺组织作为实验对照组。

1.2 方法

免疫组织化学 所有标本用中性福尔马林固定。TIPE2、VEGF、Platelet endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1/CD31)兔抗人多克隆抗体(工作浓度1:50)，均买自武汉三鹰生物技术有限公司。即用型ER、PR、HER-2、Ki-67 抗体为福建迈新生物技术有限公司。所有乳腺癌蜡块标本经两位病理医师确诊。常规石蜡4 um 切片，免疫组织化学采用SP 法，实验组及对照组用相同的实验条件和方法，用PBS 液替代一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

免疫组织化学 根据美国临床肿瘤学会ASCO 分级分别 对TIPE2、VEGF、CD31、ER、PR、HER-2、Ki-67进行结果的判读。TIPE2、VEGF、 CD31 阳性：在细胞浆见棕黄色颗粒，HER-2 阳性：在细胞膜见棕黄色颗粒,ER、PR、HER-2、Ki-67 阳性：在细胞核见棕黄色颗粒。染色阳性的肿瘤细胞面积＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分别计为0、1、2、3、4 分。肿瘤细胞着色强度分别标记-、+、++、+++，分别计为0、1、2、3 分。将这两个数值相乘，＜8 分判定为低表达，≥8 分判定为高表达。

1.4 统计学分析

实验数据均采用SPSS 17.0 统计软件处理，所占的百分比用n(%)表示，实验组、对照组的差异采用检验、卡方检验，并采用Logrank 生存曲线分析和Spearman 相关性分析，＜0.05 视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TlPE2、VEGF 在乳腺癌组织中的表达

TIPE2 在乳腺癌组织中表达降低，在正常乳腺组织中强表达。VEGF 在乳腺癌组织中表达升高，在正常乳腺组织中表达较低(图1)。

图1 正常乳腺组织及乳腺癌免疫组化表达(HE×400)(①正常乳腺组织TlPE2 高表达 ②高级别乳腺癌TlPE2 低表达 ③正常乳腺组织VEGF 低表达④高级别乳腺癌VEGF高表达 ⑤乳腺癌Ki-67 高表达)

2.2 TlPE2、VEGF 与临床病理参数间的关系

TIPE2 在乳腺癌中的表达明显低于正常乳腺组织，差异有统计学意义(＜0.005)。TIPE2 低表达与肿瘤TNM 分期差异有统计学意义(=0.017)、淋巴结转移差异有统计学意义(=0.031)、组织学分级差异有统计学意义(=0.010)、Ki67 指数高差异有统计学意义(=0.010)临床病理参数相关，但与ER、PR、HER2 的表达、肿瘤大小、年龄无关，见表1。

VEGF 在乳腺癌中的表达明显高于正常乳腺组织，差异有统计学意义(＜0.005)。VEGF 高表达与肿瘤TNM 分期差异有统计学意义(=0.001)、淋巴结转移差异有统计学意义(=0.012)、组织学分级差异有统计学意义(=0.030)、Ki-67 指数高差异有统计学意义(=0.003)相关，但与ER、PR、HER-2 的表达、肿瘤大小、年龄无关，见表1。

表1 乳腺癌组织中TlPE2、VEGF的表达与临床病理参数的关系

2.3 TlPE2、VEGF 之间的相关性分析及与血管形成的关系

TIPE2 的表达与VEGF 的表达呈负相关，差异有统计学意义(r ＝-0.271，＝0.002)，而且TIPE2 低表达的患者提示预后不良，差异有统计学意义(=0.028)(图2)，同时发现TIPE2 低表达且VEGF 高表达的乳腺癌组织中血管形成较密集(用CD31 显示血管内皮)(图3，表2)。

图2 TlPE2 与VEGF 相关性及预后 ①TlPE2 与VEGF 表达的相关性(P ＝0.002)②乳腺癌TlPE2 低表达且VEGF 高表达患者生存曲线。

图3 血管形成密度的对比(CD31 标记血管内皮)①血管形成疏松区②血管形成密集区

表2 乳腺癌组织中TlPE2低表达且VEGF高表达与血管形成的关系

3 讨论

育龄期女性因为其激素水平及机体代谢因素，在癌症人群中属于特殊的群体。随着现代医学技术的日益更新，对于癌症的过早诊断和治疗显著提高了乳腺癌患者的预后，但是乳腺癌仍然是育龄期女性癌症导致死亡的首要因素。

TIPE2 是2002年发现的一种基因，TIPE2 参与免疫反应，负性调控免疫应答。该基因编码的蛋白由6 个反向平行α 螺旋组成，受到抗原刺激时可以激活免疫反应，通过抑制T 细胞受体(TCR)和Toll 样受体(TLR)信号转导对炎症和免疫内环境的负性调节，维持机体的免疫稳态。近几年文献指出TIPE2 也与恶性肿瘤密切相关。TIPE2 通过抑制AKT 和 IκBα 磷酸化的过程负性调控肿瘤细胞的增殖，抑制胃癌的发生发展过程。此外，TIPE2 抑制非小细胞肺癌发展，并通过抑制PI3K/Akt 通路参与抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。在乳腺癌的相关报道中发现TIPE2 通过抑制AKT 和P38 通路调节乳腺癌细胞的增殖和转移能力。本实验通过免疫组织化学方法研究乳腺癌组织中TIPE2的表达变化情况，数据显示TIPE2 在乳腺癌组织中的表达明显降低，并且TIPE2 的低表达与乳腺癌的组织学分级、淋巴结转移、增殖指数和TNM 分期等恶性生物学行为相关，这与前述文献报道结果相吻合。并且我们的数据显示TIPE2 低表达的育龄期女性患者预后明显不良。我们根据实验结果提示TIPE2 可作为评估乳腺癌预后的指标。

VEGF 是一种重要的生长因子，它促进血管的生成，并且对血管内皮细胞具有促进有丝分裂和抗凋亡的作用，可增加血管通透性，促进细胞迁移等，它积极参与调节正常和病理的血管生成过程。在恶性肿瘤的生长过程中新生血管的形成对肿瘤细胞的生长微环境至关重要。在许多恶性肿瘤中存在VEGF 表达增多的现象，VEGF 参与了肿瘤的发生发展。对于VEGF 在肿瘤中的作用机制，近几年也有一些深入的研究。文献指出，VEGF在肿瘤生长过程中不只是参与促进新生血管的形成，还有特定的生物学意义。

Li 等在非小细胞肺癌的实验中发现，TIPE2 通过抑制Rac 通路降低VEGF 的作用从而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力。并且有文献报道TIPE2 有抑制乳腺癌细胞的增殖和转移的能力。我们在实验中，通过免疫组织化学方法发现TIPE2 在乳腺癌组织中的显著比周围正常乳腺组织呈现低表达，并且TIPE2 的低表达与乳腺癌的组织分级、TNM 分期、Ki-67 指数高等乳腺癌的恶性行为相关，TIPE2 低表达的育龄期女性乳腺癌患者的预后不良。同时，数据显示VEGF 在乳腺癌中呈高表达，TIPE2 与VEGF 的表达负相关，同时存在VEGF 高表达并TIPE2 低表达的乳腺癌组织中，血管形成的密度明显高于其他的病例组。因此认为，TIPE2 在乳腺癌中与VEGF 起协同作用。我们可以推断TIPE2 通过VEGF 参与的肿瘤血管形成过程作用于乳腺癌的发生发展，这为以后乳腺癌的机制研究提供数据支持。

随着医学技术的进步和发展，深入分子化学研究探讨乳腺癌等恶性肿瘤的发病机制成为临床医学领域中课题研究的重点。乳腺癌现有的诊疗技术中对于乳腺癌的复发和转移仍然是目前治疗的难点。随着越来越精细的精准个体化治疗，我们期待于寻找新的用于乳腺癌临床治疗的基因靶点。通过以上分析发现，TIPE2 可能作为肿瘤治疗的靶点。

综上所述，我们在实验中发现，在育龄期女性乳腺浸润性导管癌的发生发展中，TIPE2 的低表达与多种临床病理参数相关，并且可以作为评估育龄期女性乳腺癌患者临床预后的指标。TIPE2 和VEGF 的表达可以一定程度反映乳腺癌的病情发展。TIPE2 可能成为一个重要的靶分子，通过经VEGF 参与的血管内皮细胞的生长参与乳腺癌的发展。但由于我们的研究条件有限。接下来的研究方向是通过更复杂的体外实验明确TIPE2 在乳腺癌的作用机制，构建TIPE2 参与影响肿瘤血管形成的完整通路，有利于进一步指导育龄期女性乳腺癌的临床评估和治疗。