两种海藻对模拟海水养殖废水脱氮、除磷能力研究

王绍迁 张恩栋 王思涵

摘    要：利用固定化海洋微藻进行海水水产养殖废水中氮、磷的去除能力研究。首先探讨了海洋微藻小球藻（Chlorella sp.）和绿色巴夫藻（Pavlova viridis）对高浓度氨氮的耐受性。其次研究了海藻的脱氮、除磷能力。结果表明：2～10 d微藻生长与对照比无抑制现象，表明两种海洋微藻对20～100 mg·L-1氨氮具有强耐受力。固定化胶球中细胞密度对氮磷去除有影响，对氮去除的适宜藻细胞密度是250万·胶球-1，对磷高去除的细胞密度是1 000万·胶球-1。小球藻的脱氮除磷能力大于绿色巴夫藻，在50 mg·L-1初始浓度下，5 d氨氮去除率为33.8%。5 d磷最高达到32.0%。去污结束时，藻细胞均有生长，固定化细胞1 000万·胶球-1增长率最低。本研究可为藻类净化海水养殖废水提供一定参考。

关键词：固定化;海藻;海水养殖废水;污水处理

中图分类号：X173;X55         文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.017

Research of Removal Capacity of Ammonia-Nitrogen and Phosphate-Phosphorus from Simulated Mariculture Wastewater by Two Species of Marine Microalgae

WANG Shaoqian1，2，ZHANG Endong1，WANG Sihan1

（1.School of Life Science， Liaoning Normal University， Dalian， Liaoning 116081， China; 2.Yutai No. 1 Senior High School， Jining， Shandong 272300， China）

Abstract：The purpose of this study is to clarify the removal ability of ammonia-nitrogen and phosphate-phosphorus from marine aquaculture wastewater by immobilized marine microalgae. Firstly， the tolerance of marine microalgae Chlorella sp. and Pavlova viridis to high concentrations of ammonia-nitrogen was studied. Secondly，the removal rates of ammonia-nitrogen and phosphate-phosphorus were detected. The results showed that the growth of microalgae was not inhibited by ammonia-nitrogen during 2-10 d， indicating that the two marine microalgae had strong tolerance to 20-100 mg·L-1 ammonia-nitrogen. Nitrogen and phosphorus removal efficiency can be influenced by cell density of immobilized beads. The optimal cell density of algae for nitrogen removal was 2.5 million·bead-1， and the optimal cell density for high phosphorus removal was 10 million·bead-1. The nitrogen and phosphorus removal capacity of Chlorella sp. was higherthan that of Pavlova viridis.While， the ammonia-nitrogen removal rate had reached 33.8% at the initial concentration of 50 mg·L-1 ammonia-nitrogen after 5 d and phosphate-phosphorus removal rate was 32.0%. After wastewater treatment， the counts of cells increased under each condition.The immobilized cells had the lowest growth rate at density of 10 million per bead. Some reference for the purification of marine aquaculture wastewater by algae maybe provided.

Key words： immobilized; marine algae; marine aquaculture wastewater; wastewater treatment

隨着人们对海产品需求量增大，海水养殖业迅猛发展。沿海育苗场及养殖场废水排放量与日俱增，导致近岸海域水质恶化。由于海水盐度效应增加了处理难度和海水养殖废水中残余饲料和排泄物中有机物、氨氮、磷的积累[1-2]，对水体造成严重污染。同时氨氮也是水产养殖的胁迫因子，对集约化养殖牙鲆[3]、青鳉[4]、刺参[5]等动物[6]的生长、能量代谢和免疫力等造成不良影响，甚至导致死亡。藻类处理方法已广泛应用于营养物质去除研究中[7-8]，利用藻类去除氮、磷的生物处理方法与物理、化学方法相比具有高效、低耗和不带来二次污染的特点[9]。此外，与传统活性污泥法比，藻类处理产生相当数量的生物量可以用来制备生物燃料使得该方法具有经济效益[8]。除了作为可再生资源的生物质[10]，使用微藻在污水处理中可以实现二氧化碳生物固定[11-12]，微藻直接吸收氨和磷酸盐，并协同促进细胞生长和代谢功能，具有成本效益和可行性。固定化技术使得藻细胞浓度高，有利于藻类的收获，同时减少有毒物质的毒性而使体系更稳定[13]。适宜藻种的筛选、处理条件的选择、处理系统的优化都将影响到污染物处理效果和生物质能的获得。有一些利用小球藻[13-16]、绿色巴夫藻[17]、江蓠[18]等进行海水养殖废水氮磷去除研究的实例，包括对藻细胞数量、养殖水体稀释率、温度、光照和盐度等[19-20]。但仍有很多需要解决的问题[21]，其中具有较好氮磷去除能力的藻种的获得也是一个关键，本文研究了小球藻和绿色巴夫藻对高氨氮的耐受性和固定化藻胶球细胞密度对污水中氮、磷去除能力影响，旨在为藻类海水养殖废水净化技术提供一定参考。

1 材料和方法

（1）藻种及培养：小球藻（Chlorella sp.，辽宁省海洋水产科学研究院），绿色巴夫藻（Pavlova viridis，辽宁师范大学藻类生理生化实验室）。使用f/2培养基，温度为（24±2）℃，光强为2 500±100 lux，光周期10∶14（光∶暗），光照培养箱培养，绘制生长曲线，取静止初期材料进行试验。

（2）氨氮耐受试验：以f/2培养基为基础，添加氯化铵和磷酸二氢钠，使NH4 + -N浓度为0，20，40，80，100 mg·L-1，PO4  3     --P 1.5 mg·L-1，高压灭菌后使用。藻离心（3 000 r·min-1，10 min）后，培养在200 mL人工污水中，使接种细胞密度为1.0×106 cell·mL-1，同藻培养相同条件培养后，每24 h测定生长状况。

（3）固定化和脱固定化方法：藻细胞用无氮、磷f/2培养基悬浮，与6%海藻酸钠溶液等体积混合。用带7号针头注射器滴入0.1 M CaCl2中，静置1 h后用无氮、磷培养基洗涤后使用。固定化海洋微藻细胞胶球密度分别为2.5×106，5.0×106，1.0×107 cell·胶球-1，胶球静止培养，培养条件同材料培养。脱固定时取海藻胶球加入3%的柠檬酸钠溶液定容，胶球溶解后计数。

（4）模拟水产养殖废水：模拟水产养殖废水中其他条件同藻培养，氨氮浓度为50 mg·L-1，使PO4  3     --P濃度为5 mg·L-1，每24 h测定氮、磷。

（5）指标测定：生物量采用血球计数板计数藻细胞密度，氨氮采用靛酚蓝法[22]，PO4  3    --P采用磷钼蓝分光光度法[22]。

2 结果与分析

2.1 两种海藻对氨氮的耐受性

小球藻、绿色巴夫藻随时间生长状况如图1所示，小球藻（图1-A）、绿色巴夫藻（图1-B）在0，20，40，80和100 mg·L-1氨氮模拟废水中生长。20～100 mg·L-1氨氮添加后的第1天均出现生长延滞，第2～10天微藻生长良好，与对照比无明显抑制现象，表明两种海洋微藻对高浓度氨氮具有强耐受能力。

2.2 固定化小球藻和绿色巴夫藻脱氮、除磷研究

2.2.1 胶球细胞密度对脱氮、除磷的影响 静止培养条件下考察两种藻去除氮、磷能力（图2）。随时间增加，氨氮去除率逐渐增大。

当胶球细胞密度为250万·胶球-1（图2A），小球藻5 d氨氮去除率达到33.8%，去除量达到16.9 mg·L-1，而500万·胶球-1，1 000万·胶球-1去除率低于250万·胶球-1。去除氨氮能力优于已发表的小球藻[13]。绿色巴夫藻细胞胶球密度为250万·胶球-15 d氨氮去除率最高达到28.0%（图2B），去除量达到14.0 mg·L-1。去除氨氮能力优于已发表的绿色巴夫藻[18]。空白胶球对氨氮有一定吸附作用，500万·胶球-1，1 000万·胶球-1密度下由于光的相互遮挡影响对高胶球细胞条件下对氮的吸收下降，也可能是胶球的传质效率下降[23]。

小球藻细胞胶球密度为1 000万·胶球-1时（图3-A），5 d磷去除率最高达到31.1%。绿色巴夫藻细胞胶球密度为1 000万·胶球-1最高达到21.2%（图3-B）。空白胶球对磷有一定的吸附作用。两种海藻适宜除磷胶球细胞密度1 000万·胶球-1。

2.2.2 藻细胞生存力   2种海藻污水处理前后细胞数见图4。固定化后海藻生长状况良好，细胞有增量，随着初始细胞负载增大，绿色巴夫藻生长速率下降明显。绿色巴夫藻在1 000万cell·胶球-1条件下，很明显其生长受到抑制，原因可能是因高细胞密度导致光照减少生长受到影响。

3 结论与讨论

3.1 两种海藻对氨氮的耐受性

废水中的氨氮毒性是限制藻类技术在废水处理中的应用的因素之一[24]。高浓度的氨氮中游离氨和NH4 + 互相转换，对微藻起毒害做用的主要是游离氨[25]。游离氨为不带电荷的脂溶性物质，容易通过膜扩散进入细胞内，对大多数微藻产生毒害作用[26-27]，抑制藻类生长。姜人源等[25]研究利用藻类对沼液高氨氮去除时，当ρ（NH3-N）为126 mg·L-1，小球藻生长良好，生物质浓度为4. 91 g·L-1。当ρ（NH3-N）为205 mg·L-1时，小球藻生长明显受抑制。而本试验小球藻、绿色巴夫藻对20～100 mg·L-1氨氮具有耐受性。藻类生长良好，没有受到明显的抑制。

3.2 固定化小球藻和绿色巴夫藻脱氮、除磷研究

固定化能够显著提高藻细胞的稳定性和寿命等，有利于后续的收获。而包埋法因操作简单、成本低、对细胞伤害小而广泛被使用[28-29]。藻细胞的包埋密度和藻球用量影响污染物的去除效果。已有研究均表明，NH4 +  -N 和PO4  3  --P 的去除率随着淡水藻细胞包埋密度的增加而增加。但是低包埋密度条件下单位细胞对氮、磷的去除效果优于高密度[30-31]。与丁一等[13]和本研究关于密度对小球藻净化海水养殖废水试验结论一致。

氮营养盐水平对微藻生长及营养盐代谢有重要影响，可被利用并合成蛋白质、核酸等。小球藻生物量、比生长速度、生物量生产率均随氨氮浓度的增加先增加后降低[31]。磷也是微藻生长必需的营养元素之一，废水中磷的去除效果直接受藻类生长状况影响。藻类因自身特殊生理结构和新陈代谢能力，能利用污水中氮、磷等营养物质合成复杂的有机质，本文中的小球藻的脱氮除磷能力大于绿色巴夫藻。藻类生理是一个复杂的过程，对氮磷的吸收利用也跟代谢水平、碳、氮、磷比[32]、温度、光等内外因素有关。因此，在进行污水资源化利用过程中注意培养方式既能高效净化污染物，又能达到与生物质积累的耦合。

固定化藻细胞技术能保持较高的藻细胞负载。在试验中细胞负载需要调整到适合的大小，密度增加可导致光照减少而影响细胞生长。因为在一定范围内的低光照条件下，光照强度与藻类光合作用效率成正比[33]，但有关海水固定化微藻报道较少。对新月菱形藻制备参数对藻球性质研究表明，不同褐藻酸钠质量分数和不同溶剂对固定化藻球藻细胞生长及去氮磷效率影响显著，其中以3.0%褐藻酸钠加海水的藻细胞生长最快，去除氮磷效率最佳[34]。与本研究采用3.0%的褐藻酸钠载体浓度一致。小球藻和绿色巴夫藻在试验条件下生长良好。

在微藻中，无机氮在微藻中的同化作用与碳代谢相关，需要酮酸形式的碳骨架将N转化为有机化合物。磷是参与无数代谢途径的重要元素，是磷脂、核苷酸的结构成分，也是生物能量货币ATP的组成部分。N、P可转化并用与藻类生长和代谢。本研究中两种海藻在静置模拟模式中具有良好的脱氮、除磷能力，为后续气升式反应器研究奠定基础。

综上所述，小球藻、绿色巴夫藻对20～100 mg·L-1氨氮具有耐受性，在50 mg·L-1初始浓度氨氮和5 mg·L-1磷酸磷的模拟海水养殖废水中，静置模式下5 d具有良好的脱氮、除磷潜能，可作为海水养殖废水脱氮除磷备选藻种。

参考文献：

[1] LU S L， WANG Q Z， GAO M C， et al. Effect of aerobic/anoxic duration on the performance，microbial activity and microbial community of sequencing batch biofilm reactor treating synthetic mariculture wastewater[J]. Bioresource Technology， 2021， 333： 125198.

[2] 尹延明， 高怡菲， 李伊晗， 等. 电氧化法去除海水养殖循环水中氨氮机制研究[J]. 水处理技术， 2021， 47（6）： 70-74， 79.

[3] 韩英， 蔺佳文， 吕晓楠， 等. 氨氮急性胁迫下二、三倍体雌性虹鳟应激耐受性比较[J]. 东北农业大学学报， 2021， 52（5）： 49-58.

[4] 高娜， 朱丽梅， 于德良， 等. 长期高氨氮暴露对海水青鳉毒理效应的蛋白质组学研究[J]. 热带海洋学报， 2017， 36（5）： 40-48.

[5] 胡炜， 赵斌， 李成林， 等. 慢性氨氮胁迫对刺参摄食与消化酶活性的影响[J]. 中国水产科学， 2018， 25（1）： 137-146.

[6] 韩朝婕， 陈屹洋， 贺振楠， 等. 氨氮胁迫对水产动物生长、消化酶及免疫影响的研究进展[J]. 河北渔业， 2021（5）： 32-35.

[7] 马航， 李之鹏， 柳峰， 等. 微藻膜反应器处理海水养殖废水性能及膜污染特性[J]. 环境科学， 2019， 40（4）： 1865-1870.

[8] ARUN S， SINHAROY A， PAKSHIRAJAN K， et al. Algae based microbial fuel cells for wastewater treatment and recovery of value-added products[J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews， 2020， 132： 110041.

[9] CHAN A SALSALI H， MCBEAN E. Nutrient removal （nitrogen and phosphorous） in secondary effluent from a wastewater treatment plant by microalgae[J]. Canadian Journal of Civil Engineering， 2014， 41（2）： 118-124.

[10] DAS S， NATH K， CHOWDHURY R. Comparative studies on biomass productivity and lipid content of a novel blue-green algae during autotrophic and heterotrophic growth[J]. Environmental Science and Pollution Research International， 2021， 28（10）： 12107-12118.

[11] KONG W W， SHEN B X， LYU H H， et al. Review on Carbon dioxide fixation coupled with nutrients removal from wastewater by microalgae[J]. Journal of Cleaner Production， 2021， 292： 125975.

[12] HU X， LIU B， ZHOU J， et al. CO2 fixation， lipid production， and power generation by a novel Air-Lift-Type microbial Carbon capture cell system[J]. Environmental Science & Technology， 2015， 49（17）： 10710-10717.

[13] 丁一， 侯旭光， 郭戰胜， 等. 固定化小球藻对海水养殖废水氮磷的处理[J]. 中国环境科学， 2019， 39（1）： 336-342.

[14] 王伟伟， 陈书秀， 钱瑞， 等. 海水养殖废水预处理方法与微藻藻种筛选[J]. 水产科学， 2014， 33（3）： 181-185.

[15] 陈凡雨， 徐仲， 尤宏， 等. 缺氧MBR-MMR处理海水养殖废水性能及膜污染特性[J]. 环境科学， 2020， 41（6）： 2762-2770.

[16] 崔伟， 高锋， 朱凤， 等. 利用膜-光生物反应器（MPBR）连续培养微藻去除海水养殖废水中营养盐的研究[J]. 浙江海洋学院学报（自然科学版）， 2019， 38（1）： 68-75.

[17] 马冬冬. 基于微藻的光-膜组合式生物反应器处理海水养殖业废水[D]. 青岛： 中国海洋大学， 2005.

[18] 钟非， 黎慧， 仲霞铭， 等. 四种饵料微藻对海水养殖水体N、P的去除研究[J]. 环境科学与技术， 2011， 34（11）： 113-117.

[19] CHEN X， XIANG Z Z， HUANG X， et al. Effect of C/N ratio on Nitrogen removal of A/O-MBBR process for treating MaricultureWastewater[J]. Journal of Ocean University of China， 2021， 20（4）： 879-885.

[20] GAO Y， GUO L， LIAO Q， et al. Mariculture wastewater treatment with Bacterial-Algal Coupling System （BACS）： Effect of light intensity on microalgal biomass production and nutrient removal[J]. Environmental Research， 2021， 201： 111578.

[21] JIAQI S， LIFEN L， FENGLIN Y. Successful bio-electrochemical treatment of nitrogenous mariculture wastewater by enhancing Nitrogen removal via synergy of algae and cathodic photo-electro-catalysis[J]. The Science of the Total Environment， 2020， 743： 140738.

[22] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会. 海洋监测规范第4部分： 海水分析：GB 17378.4-2007[S].北京： 中国标准出版社， 2008.

[23] TANAKA H， MATSUMURA M， VELIKY I A. Diffusion characteristics of substrates in Ca-alginate gel beads[J]. Biotechnology and Bioengineering， 1984， 26（1）： 53-58.

[24] LU Q， CHEN P， ADDY M， et al. Carbon-dependent alleviation of ammonia toxicity for algae cultivation and associated mechanisms exploration[J]. Bioresource Technology， 2018， 249： 99-107.

[25] KÄLLQVIST T， SVENSON A. Assessment of ammonia toxicity in tests with the microalga， Nephroselmis pyriformis， Chlorophyta[J]. Water Research， 2003， 37（3）： 477-484.

[26] 姜人源， 朱順妮， 王忠铭， 等. 不同pH条件下小球藻氨氮处理及生物质生产能力[J]. 环境工程， 2021， 39（9）： 42-47.

[27] 罗龙皂， 林小爱， 朱峰， 等. 曝二氧化碳气体对近具刺链带藻在高氨氮废水中生长的影响[J]. 浙江农业学报， 2019， 31（9）： 1541-1548.

[28] 杨坤， 侯冠军， 赵秀侠， 等. 固定化栅藻对养殖废水的净化效果及生长研究[J]. 渔业研究， 2019， 41（6）： 509-513.

[29] 丁玉惠， 黄晨， 陈锵， 等. 固定化新月菱形藻的制备及其对N、P吸收的影响[J]. 宁波大学学报（理工版）， 2017， 30（3）： 12-18.

[30] 梁晶晶， 蒋霞敏， 江茂旺， 等. 固定化微绿球藻去除NH4 + -N、PO4  3 --P效果的研究[J]. 水生生物学报， 2016， 40（5）： 1033-1040.

[31] 孔佳， 沈伯雄， 孔文文， 等. 微藻在不同氨氮条件下固定CO2耦合净化废水的实验研究[J/OL]. 环境工程： 1-15. （2022-01-11）[2022-01-12]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2097.X.20220110.1759.004.html.

[32] 商洪国， 吴楠， 韩飞， 等. 微藻对海水养殖循环水高效碳氮磷一体化去除的研究[J]. 环境科学学报， 2021， 41（9）： 3408-3417.

[33] 娄孝飞， 杜延生， 张海平. 基于细胞尺度的光照对四尾栅藻生长的影响[J]. 中国环境科学， 2020， 40（11）： 5020-5026.

[34] 黄晨， 蒋霞敏， 韩庆喜， 等. 新月菱形藻（Nitzschia closterium）制备参数对藻球性质及去氮磷效果的影响[J]. 宁波大学学报（理工版）， 2020， 33（1）： 32-37.