灰树花子实体多糖硫酸酯化及抗凝血活性研究

杨庆伟，王 芃，全迎萍

(1.天津现代职业技术学院 生物工程学院，天津 300350；2.天津大学 理学院，天津 300354；3.天津大学 化学化工国家级实验教学示范中心，天津 300354)

灰树花(Grifolafrondosa)俗称“舞菇”，在日本又称“舞茸”，是食、药兼用的真菌。灰树花子实体肉质柔软，外观层叠似菊，含有丰富的多糖、蛋白质、维生素等营养物质[1-2]，主要分布在日本北部、美国和欧洲等地区。国内外对于灰树花的研究主要集中在灰树花多糖的生物活性方面[3]，尤其对抗肿瘤[4-5]和抗氧化活性[6-7]的研究成为近十年的研究热点，还有少数研究降血脂[8]、降血糖[9]、免疫调节[10]和抗病毒[11]等生物活性，近几年灰树花多糖对小鼠血脂、血糖与肠道菌群关系的研究受到越来越多的关注[12]。这些研究的活性物质绝大多数都是水溶性灰树花多糖，而水不溶性多糖需要改造才具有生物活性。如果多糖上的羟基被硫酸根基团取代，就能够提高多糖在水中的溶解度，也改变了多糖链的构象，多糖的生物活性也得到了改进[13-14]，比如研究硫酸酯化灰树花多糖的抗肿瘤[15]、抗血管增生[16]的活性。肝素作为一种天然的硫酸酯化多糖具有抗凝血活性, 已经广泛地应用于临床中[17]，但是肝素也有副作用。肝素的抗凝血作用与分子结构中的硫酸根含量和负电荷有关。近年来已经有研究表明，经过硫酸酯化修饰的多糖具有一定的溶血现象和抗凝血活性[18-19]。目前国内外还没有对灰树花子实体多糖进行抗凝血活性的研究。本文对灰树花子实体水不溶性多糖进行硫酸酯化，并优化工艺条件，使其能够达到水溶性，提高灰树花多糖的利用率和活性，并对硫酸酯化多糖进行抗凝血实验研究。

1 材料

1.1 材料与试剂

灰树花子实体(浙江庆元高山农产品批发商部)；氯磺酸(分析纯，天津市元立化工试剂厂)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶(分析纯，天津市光复化工研究所)；APTT、PT、TT试剂盒(天津威仕达公司)；凝血酶(北京普博欣生物科技有限责任公司)；纤维蛋白原、肝素钠(Sigma)。

1.2 仪器与设备

冷冻干燥机(LGJ0.5)(北京四环科学仪器厂)；冷冻离心机(Heraeus)；全自动血液凝固仪(CA-7000)(Sysmex)；葡聚糖凝胶(Sephadex G50)(北京欣经科生物技术有限公司)；自动部分收集器(上海沪西仪器厂)。

2 方法

2.1 水不溶性多糖的提取

将灰树花子实体粉碎过筛，加去离子水至灰树花含量的50%，用超声波在冰水浴下裂解10 min，然后加去离子水稀释到5%，80℃水浴6 h，每隔30 min搅拌1次。水浴结束，将底部残渣倒入2.5% 氢氧化钠(NaOH)溶液中，并在4℃条件下过夜。去除底部残渣，上清液用冰乙酸中和，所得沉淀经过4 000 r·min-1离心，在0.05 mol·L-1的NaOH溶液中溶解，再经过4 000 r·min-1离心，用3倍体积的95%乙醇沉淀上清液，低温沉淀8 h，将沉淀物真空干燥，得到碱提水不溶性粗多糖GF[20]。

2.2 硫酸酯化多糖制备工艺优化

采用改进的氯磺酸—吡啶法[21]：无水吡啶(40 mL)置于反应瓶中，冰盐浴冷却，剧烈搅拌下缓慢加氯磺酸20 mL，继续搅拌30 min，备用。将GF(100、200、300 mg)悬浮于DMF(100 mL)中，倒入上述反应瓶中，于40、50、60、70℃下搅拌反应2、3、4 h，用2.5 mol·L-1NaOH中和，加入95 %的乙醇，离心分离，收集沉淀，将沉淀溶于100 mL蒸馏水中，装入透析袋进行透析(流水透析2 d，蒸馏水静置透析1 d)，冷冻干燥得到硫酸酯化多糖S-GF。以硫酸酯化多糖的产率和硫酸基团的取代度作为指标，考查原料比例、反应温度和反应时间3个因素的影响规律。

1)单因素条件筛选实验

反应温度对硫酸酯化反应结果的影响：在硫酸酯化过程中，反应温度为40、50、60、70℃下搅拌3 h，加入200 mg GF ，其他条件不变，得出产物计算产率：

硫酸酯化产率/%=(m1-m2)/m1×100%。

(式中：m1为硫酸酯化多糖S-GF的质量，g；m2为GF的质量，g)

2)固定温度下的优化实验

在上述反应温度这个单因素研究的基础上，将反应温度固定在60℃，以原料与氯磺酸不同比例和反应时间为因素，每个因素采用3个水平，进行2因素3水平全面优化实验，其他条件不变，计算产率和硫酸基取代度。

硫酸根含量测定方法：

氯化钡—明胶浊度法，多糖中含有的硫酸基团用取代度来表示，取代度表示每个单糖残基上含有硫酸基团的平均个数：

取代度=162×S%/(3 200-102×S%)。

(式中：S%为硫酸基团的百分含量)

2.3 硫酸酯化多糖的纯度鉴定

Sephadex G50凝胶柱层析：取1 mL浓度为10 mg·mL-1的多糖溶液，上 Sephadex G50 凝胶柱(1 cm×10 cm)，用去离子水作为洗脱液，流速为 0.25 mL·min-1，分管收集(每管 8 min)，利用苯酚—硫酸法检测每管多糖的含量，绘制层析图谱。

2.4 抗凝血实验

所有凝血实验均使用自动凝血仪测量。利用0.9%的氯化钠溶液配制不同浓度的S-GF(0、20、40、80 μg·mL-1)待测样品和肝素钠(2 μg·mL-1)对照样品。APTT、TT、PT凝血时间的测定方法和流程如图1所示[22]。

图1 APTT、TT、PT测试流程图Fig.1 APTT、TT、PT Test Flow Chart

2.5 溶栓实验

纤维蛋白原是凝血过程中的一种蛋白质，是主要的凝血因子。溶栓活性采用纤维蛋白板法测定。首先分别将10 mL 0.25%(w/v)纤维蛋白原溶液、0.5 mL(60 U·mL-1)凝血酶溶液和5 mL 1%琼脂分别加于平板上，快速摇匀，放置30 min。然后在纤维蛋白板上钻2个小孔，取30 μL 浓度为0和200 μg·mL-1的硫酸酯化多糖S-GF生理盐水(0.9%)溶液，加入2孔中，37℃孵育8 h。

3 结果与分析

3.1 硫酸酯化工艺条件的确定

单因素条件筛选实验：由图2可知，反应温度对酯化产物的得率影响显著。在60℃以下，硫酸酯化的产率随反应温度的升高而增大，60℃时产率最高，大于60℃时产率逐渐下降，可能由于多糖在高温的酸性环境下发生了降解，因此确定硫酸酯化工艺中的最佳反应温度为60℃。

图2 反应温度对硫酸酯化产率的影响Fig.2 Effect of Reaction Temperature on Sulfate Yields

固定温度优化实验条件：由表1可知，其他条件不变，产率和取代度都会随反应时间的增加而增加，但是在3 h以后，反应产率的增加很有限，所以考虑时间成本，确定最优反应时间为3 h。在反应时间相同时，GF(mg)：氯磺酸(mL)越小，反应产率和取代度越高，但是低于10∶1时，产率和取代度增加不明显，从节约成本的角度确定最优GF(mg)∶氯磺酸(mL)为10∶1。最终确定在GF∶氯磺酸=200 mg∶20 mL时，60℃下反应3 h的条件为硫酸酯化工艺的最佳条件，得到硫酸酯化多糖S-GF的含硫量为17.5%，硫酸基取代度为2.01。

表1 不同条件对GF硫酸酯化的影响Table 1 Effects of Different Conditions on GF Sulfation

*0.01

3.2 S-GF纯度鉴定结果

经过 Sephadex G50 凝胶柱层析分析结果(图3)，可以看到只有一个单一的洗脱峰，说明S-GF为均一组分。

图3 S-GF的Sephadex G50层析图谱Fig.3 Sephadex G50 Chromatogram of S-GF

3.3 S-GF抗凝血活性

采用APTT、PT、TT法对不同浓度硫酸多糖(S-GF)的抗凝活性进行评价。体外实验结果如图4所示，相对空白样品(0 μg·mL-1)，不同浓度的S-GF均能有效延长APTT和TT，并且随着浓度的增大，APTT和TT延长的时间越长，而PT凝血时间没有大的变化。APTT作为内源性凝血途径的过筛实验，TT作为血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过筛实验，PT作为外源性凝血途径的过筛实验。因此，S-GF的抗凝血机制是通过内源性凝血途径来完成的，而不是通过外源性凝血途径。肝素钠(2 μg·mL-1)的APTT比S-GF(20 μg·mL-1)的时间长，PT明显比S-GF时间长，虽然TT比S-GF时间短，但是考虑到肝素钠的浓度低于待测样品的1/10，说明S-GF的抗凝血活性比肝素钠低。

4 结论

灰树花子实体经过醇沉、碱提得到水不溶性多糖组分GF，对硫酸酯化工艺中的反应温度、时间、原料比例条件进行优化，最终确定硫酸酯化温度为60℃、时间3 h。GF：氯磺酸=200 mg:20 mL为最佳工艺条件,得到的硫酸酯化多糖S-GF的取代度为2.01。经过Sephadex G50柱层析证明S-GF为均一组分。通过对S-GF的活性部分进行 APTT、TT和PT测试，证明S-GF通过内源性凝血途径达到抗凝血作用，并且S-GF的抗凝血活性比肝素钠低。本文旨在能够将灰树花子实体多糖进行最大化利用，并应用到药物或保健品中。