菏泽市新生儿原发性肉碱缺乏症串联质谱筛查分析

汪玉锋

[摘要] 目的 了解原發性肉碱缺乏症（PCD）在菏泽市新生儿中的发病率，并对基因突变特点、治疗及预后进行分析。方法 利用串联质谱技术对2016年1月至2020年12月258 682例新生儿进行血酰基肉碱谱检测，对初筛游离肉碱（C0）低于9 μmol/L伴有多个酰基肉碱下降的新生儿及母亲进行串联质谱、二代测序基因检测。结果 共确诊游离肉碱缺乏症21例，其中9例原发性肉碱缺乏症，11例母源性肉碱缺乏症，1例父源性肉碱缺乏症。8例进行基因检测，其中7例检测到2个等位基因（孩子5例、母亲1例、父亲1例）、杂合1例。SLC22A5基因共发现10种基因突变位点：c.1400C>G、c.51C>G、c.95A>G、c.865C>T、c.680G>A、c.761G>A、c.760C>T、c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A。其中c.952-21C>G、c.572A>G以及c.1229G>A，均为新发突变位点。结论 利用串联质谱技术筛查结合二代测序技术可早期检出原发性或母源性肉碱缺乏症。经左卡尼汀治疗的患儿预后良好，可有效预防猝死。菏泽市新生儿原发性肉碱缺乏症患病率约为1/28 743，与国内已报道的发病率接近。基因检测发现10种SLC22A5基因突变位点，其中c.1400C>G位点在菏泽市出现频率较高，3个新发突变位点，新突变的位点丰富了SLC22A5基因的突变图谱。

[关键词] 原发性肉碱缺乏症;串联质谱;SLC22A5基因;新生儿

[中图分类号] R722.11;R363.25          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2022）07-0154-04

Screening analysis of neonatal primary carnitine deficiency by tandem mass spectrometry in Heze

WANG Yufeng

Neonatal Disease Screening Center，Heze Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Heze 274000， China

[Abstract] Objective To investigate the incidence of primary carnitine deficiency（PCD） in newborns in Heze， and to analyze the characteristics， treatment and prognosis of gene mutation. Methods The blood acylcarnitine carnitine profiles of 258 682 neonates from January 2016 to December 2020 were detected by tandem mass spectrometry， and the primary screened neonates and mothers with free carnitine （C0） less than 9 umol/L and multiple acyl carnitine decreases were subjected to tandem mass spectrometry and second-generation sequencing gene detection. Results A total of 21 cases of free carnitine deficiency were diagnosed， including 9 cases of primary carnitine deficiency， 11 cases of maternal carnitine deficiency and 1 case of paternal carnitine deficiency. Gene detection was performed in 8 cases， of which 2 alleles （5 children， 1 mother， 1 father） and 1 heterozygosity were detected in 7 cases. Ten mutation sites of SLC22A5 gene were found： c.1400C > G， c.51C > G， c.95A > G， c.865C > T， c.680G > A， c.761G > A， c.760C > T， c.952-21C > G， c.572A > G， c.1229G > A. Among them， c. 952-21C > G， c. 572A > G and c. 1229G > A were all new mutation sites. Conclusion The screening by tandem mass spectrometry combined with second-generation sequencing can detect primary or maternal carnitine deficiency in the early stage. Children treated with levocarnitine have a good prognosis， which can effectively prevent sudden death. The prevalence rate of PCD in newborns in Heze is about 1/28743， which is close to the incidence reported in China. Ten kinds of mutation sites of SLC22A5 gene were found by gene detection， among which c. 1400C > G site appeared more frequently in Heze， and there were 3 new mutation sites. The new mutation sites enriched the mutation map of SLC22A5 gene.

[Key words] Primary carnitine deficiency; Tandem mass spectrometry; SLC22A5 gene; Newborn

原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD）是由于细胞膜肉碱转运蛋白的编码基因SLC22A5突变致脂肪酸β氧化障碍而引发的遗传方式为常染色体隐性遗传的疾病[1]。PCD患者细胞这一功能缺陷，细胞内肉碱浓度随细胞外降低而下降，长链脂肪酸不能通过线粒体膜进行脂肪酸β氧化，从而引起心肌、肝脏、骨骼及神经系统等脏器功能受损[2]。本研究利用串联质谱技术对258 682例新生儿酰基肉碱谱筛查，对初筛游离肉碱（C0）低于9 μmol/L通知家属在当地采血机构重采末梢血进行串联复查，复筛游离肉碱（C0）低于9 μmol/L伴或不伴多个酰基肉碱下降，立即召回进一步做相关检查，联合二代测序技术共确诊21例游离肉碱缺乏症，菏泽市PCD发病率为1/28 743，基因发现了10种SLC22A5突变位点，以c.1400 C>G位点携带率最高，其中3种未报道。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2016年1月至2020年12月在菏泽市各县区所设有产科的医疗机构出生的258 682例活产新生儿为研究对象，进行酰基肉碱谱筛查前经家长同意自费，签署知情同意书。

1.2 标本采集和递送

按照《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》要求，出生72 h后经充分哺乳（6次以上）或7 d以内，用一次性采血针穿刺其足跟内或外侧采集足跟血，并滴于新生儿筛查专用滤纸，使血片自然渗透至滤纸背面，采集3个直径>8.0 mm的血斑。采集后的血斑水平悬挂，室温下自然晾干，密封保存，放于2.0～8.0℃冰箱保存。专人到各采血机构收集标本，并以全程冷链的形式运送至山东省菏泽市妇幼保健计划生育服务中心新生儿疾病筛查中心实验室检测。

1.3 方法

1.3.1检测仪器  AB SCIEX API3200串联质谱仪，SHIMADIU LC-20AD液相泵。

1.3.2检测试剂  非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测试试剂盒，HPLC级纯度的甲醇。

1.3.3检测方法  收集的样本血斑经打孔器取直径3 mm圆形滤纸片，放置于96孔U型底微孔板中，每孔加入工作溶液100 μl，覆盖微孔板。快速将微孔板放置在振荡器上，在温度为30℃（±5℃），振频为650～750 r/min的条件下震荡孵育45 min。转移至V型底微孔板中、盖板、上机检测。

1.3.4 SLC22A5基因检测分析  对游离肉碱初筛阳性伴多个酰基肉碱降低标本立即召回采血复查，同时对新生儿及母亲进行串联质谱检查，以便排除母源性肉碱缺乏，结合基因检测进行诊断。经受试者家长知情同意后，受试者和父母同时采集2 ml（EDTA抗凝）递送三方实验室（杭州甄元医学检验实验室）进行遗传代谢病panelDNA质谱基因分析，并对有致病基因位点的新生儿父母进行Sanger测序验证。

2 结果

2.1 新生儿遗传代谢病筛查确诊情况

2016年1月至2020年12月菏泽市对258 682例新生儿进行酰基肉碱谱筛查，可疑阳性人数156例，召回151例;对初筛游离肉碱（C0）低于9 μmol/L通知家属在当地采血机构重采末梢血进行串联复查，复筛游离肉碱（C0）仍低于9 μmol/L伴或不伴多个酰基肉碱下降，建议新生儿及母亲进行串联质谱检查，以便排除母源性肉碱缺乏，对高度可疑者进一步联合二代测序行遗传代谢病panelDNA质谱基因分析，共确诊游离肉碱缺乏症患者21例;其中9例原发性肉碱缺乏症，患病率为1/28 743，11例母源性肉碱缺乏症，1例为父源性患者。见表1。

2.2 诊断治疗和随访

PCD是一种避免感染、饥饿及高强度运动的治疗，需用补充左旋肉碱治疗，使血浆游离肉碱水平控制在参考范围的中低水平[3]。原发性肉碱缺乏症确诊9例（男6例，女3例），2例未治疗，7例给予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服，1个月后复查串联质谱，随着年龄增长及肉碱水平稳定，逐渐延长复诊时间;定期检测串联质谱、血糖、肝功能、肾功能、心肌酶谱等生化指标，生长发育评估等，及时调整药物剂量;治疗中的患者末次随访年龄为0.2～5.4岁，治疗前C0 5.68（3.60～7.85）μmol/L，治疗后C0 16.29（12.73～22.98）μmol/L，使游离肉碱水平控制在参考范围的中低水平，具体控制情况及临床表现见表1。母源性游离肉碱缺乏11例，初筛游离肉碱C0 2.74（0.92～6.55）μmol/L，均未治疗，未进一步做心脏超声及肝肾功能、心肌酶谱、血糖等相关生化检查，电话随访，1例孕期伴有反复低血糖、常有疲倦感或心前区不适，其他均无明显异常临床表现。初筛阳性高度可疑PCD约17例，初筛游离肉碱C0 4.74（2.30～7.86）μmol/L，复筛游离肉碱C0 6.70（2.94～10.28）μmol/L，未做进一步做相关检查，未分出原发性或继发性游离肉碱缺乏症，电话随访，均未出现任何临床表现。

2.3 基因突变分析结果

21例肉碱缺乏症患者中，8例进行遗传代谢病panelDNA质谱基因分析，5例患儿、1例母源性、1位父亲均检测到2个等位基因，1例患兒为杂合携带;除母源性PCD和父亲PCD患者基因未做Sanger测序验证;其他5例患儿均行Sanger测序验证基因变异来源，分别来自父母，共发现10种SLC22A5基因突变位点，3种新发突变未报道。见表2、图1。

3 讨论

在我国脂肪酸氧化障碍最常见的为PCD，随着越来越多地区开展串联质谱技术应用于筛查中，提高了PCD的检出率;人体内肉碱合成主要来源于外源性食物摄入，约占体内总量的75%，其余25%由肝脏和肾脏合成[4]。若母体体内游离肉碱充足，则新生儿生后短期内仍会保持充足的储备，这样会导致新生儿筛查出现假阴性;孕期母亲若为长期素食或孕吐严重不能正常进食者，早产儿、低体重、营养不良等因素使新生儿筛查结果会出现假阳性。所以检测新生儿及其母亲体内肉碱含量判断原因的主要出处[5]。本中心对初筛游离肉碱（C0）低于9 μmol/L通知家属在当地采血机构重采末梢血进行串联复查，复筛游离肉碱（CO）低于9 μmol/L伴或不伴多个酰基肉碱下降，建议新生儿及母亲进行串联质谱检查，以便排除母源性肉碱缺乏。

不同的国家和地区发病率相差较大，澳大利亚的发病率较低，约为 1/120 000[6]。我国尚无全国性患病率的统计数据，上海市统计发病率约为1/45 000[7]，浙江省约为1/22 384[8]，石家庄市发病率约为1/17 785[9]。此研究共确诊9例原发性肉碱缺乏症患儿，患病率为1/28 743，患病率介于两地之间，我国患病率远高于国外，可能与种族和地域有关。

PCD属常染色体隐性遗传病，致病基因SLC22A5定位于染色体5q31.1，包括 10 个外显子和 9 个内含子，其编码的肉碱转运蛋白由557个氨基酸组成，包含 12 个跨区和一个ATP 结合区[10]。有研究表明，SLC22A5 基因突变有180余种，多为错义突变，无义突变以及移码突变，剪接位点的突变较少，发生突变最为频繁的是1号外显子[11]。 很多研究人员认为，国内的突变主要是c.760C>T和c.1400C>G[12]。本文对8例患者行二代测序行遗傳代谢病panelDNA质谱基因分析，共检测出7例携带2个等位基因，1例为杂合变异，共检出10种SLC22A5基因突变位点其中5例携带c.1400C>G，约占71.4%。1例携带c.760C>T，约占10%，和国内发现的热点突变相比较，菏泽市热点突变以c.1400C>G为主。检测到新发突变位点c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A未见文献报道，丰富了SLC22A5基因库，为产前诊断提供更好的依据。

综上所述，PCD的主要临床表现为扩张型心肌病、肝肿大、肌无力等，部分PCD患者终生无任何异常临床表现，有些患者如果不及时医治可能会导致死亡，因此最有效的治疗方法是早期的诊断[13-14]。由于临床表现有较强的异质性、临床症状不典型，容易漏诊或误诊，依靠串联质谱技术检测血中游离肉碱的含量对PCD检出率明显增高，确诊还需结合SLC22A5基因突变分析;并且通过新生儿筛查能检出较多母亲源性PCD甚至父源性PCD。对于PCD患者需根据监测串联质谱游离肉碱水平进行个体化治疗[15]。饮食方面避免长期饥饿，多食瘦肉，病情稳定期给予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服;患者若出现感染、大型手术或出现能量代谢危象时，建议及时静脉输注葡萄糖，使血糖控制在正常范围，联合口服或静脉给予左卡尼汀剂量加大1倍，以免出现各脏器的损伤或猝死。经左卡尼汀治疗的绝大多数患儿未见明显异常临床表现，也有部分患者依从性较差，擅自停药治疗，可诱发反复低血糖、甚至能量代谢危象及猝死的严重后果[16-17]。多数患者通过左卡尼汀药物口服及对症治疗，预后良好，少数患者未治疗，时有易疲倦或心前区有不适。目前认为PCD患者需要终生和规律使用左卡尼汀治疗，避免病情发作[18]。菏泽市PCD检出率为1/28 743，基因检测菏泽市热点突变以c.1400C>G为主，与国内已报道相近，另外本中心大概将近10例新生儿干血片检查结果高度可疑游离肉碱缺乏症，因家属意识不到遗传代谢病的危害性，未进一步做相关检查，对新生儿遗传代谢病应加大宣传（教）力度，提高群众对遗传代谢病的认识，同时针对患儿家长加强健康宣教，能够保证遵医嘱治疗，正规随访，PCD患儿的良好预后才能得到保证。致病基因SLC22A5位点不仅可以作为确诊的依据，还可作为产前诊断的依据[19]。再次妊娠应在孕妇妊娠12或18周以前取胎儿绒毛或羊水检测基因位点，通过预测诊断决定是否为患儿，并提高存活率[20]。

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