亚低温对急性心肌梗死SD大鼠心肌保护的实验研究

高仁俊　　王显艳　　张鑫蕊　　肖章博　　张凤娇　　蔡彧　　赵红晔　　李懿桐　　宗浩　　王艳丽

[摘要] 目的 实验观察诱导亚低温（32℃～36℃）治疗对SD大鼠急性心肌梗死后心肌的保护。 方法 40只健康SD大鼠随机分为两组，即常温对照组和诱导亚低温实验组，建立急性心肌梗死（AMI）實验模型，结扎左前降支近端，结扎后1 h后再解除结扎，4 h后分别测定两组大鼠的左心室射血分数（LVEF）、心率（HR）和左室舒张末期压（LVEDP）、心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及TUNEL法检测心肌细胞凋亡率。 结果 亚低温组治疗后LVEF、SOD水平明显高于常温组，差异有统计学意义（P<0.05）;亚低温组治疗后HR、LVEDP、MDA水平、心肌细胞凋亡率均明显低于常温组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论  亚低温治疗通过降低心室率，提高左心室射血分数，改善左室舒张末期压以及降低心肌的氧化应激损伤及细胞凋亡率，来保护左心室心功能，从而达到对急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌的保护，最终降低病死率。

[关键词] 急性心肌梗死;亚低温;心功能;氧化应激损伤;细胞凋亡

[中图分类号] R541.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）09-0030-04

Experimental study on mild hypothermia on myocardial protection in SD rats with acute myocardial infarction

GAO Renjun1  WANG Xianyan2  ZHANG Xinrui1  XIAO Zhangbo3  ZHANG Fengjiao1  CAI Yu1  ZHAO Hongye4  LI Yitong1   ZONG Hao1   WANG Yanli1

1.Sixth Department of Cardiology， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006，China;2.Department of Pathology， Qiqihar Medical University， Qiqihar   161006，China;3.Department of Scientific Research， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar   161006，China;4. Department of Physiology， Qiqihar Medical University， Qiqihar   161006，China

[Abstract] Objective   To observe the myocardial protection of induced mild hypothermia （32℃～36℃） in SD rats with acute myocardial infarction through experiment. Methods  A total of 40 healthy SD rats were randomly divided into two groups as the normal temperature control group and the induced mild hypothermia experimental group. An acute myocardial infarction （AMI） experimental model was established. The proximal left anterior descending artery was ligated and then released 1 hour after ligation. After 4 hours， the left ventricular ejection fraction （LVEF）， heart rate （HR）， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， superoxide dismutase （SOD） level， and malondialdehyde （MDA） level were detected in the two groups. TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis rate. Results  After treatment， the levels of LVEF and SOD in the mild hypothermia group were significantly higher than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. After treatment， the levels of HR， LVEDP， MDA， and the myocardial cell apoptosis rate in the mild hypothermia group were significantly lower than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion  Mild hypothermia therapy protects left ventricular function by decreasing HR， increasing LVEF， improving LVEDP， and reducing myocardial oxidative stress damage and cell apoptosis rate， to protect ischemia/reperfusion myocardium after acute myocardial infarction， to ultimately reduce mortality rate.

[Key words] Acute myocardial infarction; Mild hypothermia; Cardiac function; Oxidative stress injury; Apoptosis

目前，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致残率仍排在心血管疾病的首位，尽最大可能快速开通闭塞冠脉是治疗的关键。多方证实已在此过程中的心肌缺血/再灌注损伤会引起心肌顿抑、氧化应激反应、炎性反应、细胞凋亡等，最终影响患者病死率、心脏功能及预后。因此，如何减轻心脏负荷、干预氧化应激反应、减轻炎性反应和减少细胞凋亡等显得尤为重要。多年来，科研工作者及临床工作者均在探索可以减轻心肌缺血/再灌注损伤的方法。

目前，已证实亚低温在减轻氧化应激反应、细胞凋亡、心功能等方面对心肺复苏、脑组织、肾脏组织等起到保护作用。且有研究证明对急性梗死心肌进行治疗时可同时干预心功能和氧化应激反应[1-4]。

本项实验研究中，通过制备SD大鼠急性心肌梗死模型，将左前降支急性闭塞1 h后，再打开结扎进行再灌注，达到心肌缺血/再灌注损伤状态，观察4 h后，以左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心率（heart rate，HR）和左室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、心肌组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平及TUNEL法检测心肌细胞凋亡率为观察指标，探讨亚低温对缺血/再灌注心肌组织的心功能、氧化应激损伤及细胞凋亡的影响，从而得出亚低温治疗可以保护急性缺血/再灌注心肌的结论。现将所得结果报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，由黑龙江省齐齐哈尔医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（黑） 2018-001。所有的动物处置均严格遵守国际伦理标准相关要求执行，并已顺利通过齐齐哈尔医学院伦理委员会严格审议。

1.2 实验试剂与仪器

超氧化物歧化酶（SOD）检测实验试剂盒（生产批号：20190506）、丙二醛（MDA）检测实验试剂盒（生产批号：20190308）、TUNEL细胞凋亡原位检测实验试剂盒（生产批号：20190602）均购自南京建成生物工程研究所，DW-3000C型小动物有氧呼吸机购自北京众实迪创科技产业发展股份有限责任公司。

1.3动物分组与造模

40只SD大鼠采用数字表法随机分为A组（亚低温治疗组）和B组（常温对照组），每组各20只。

急性心肌梗死模型的建立：两组大鼠均持续监测直肠温度4 h，其中给予诱导亚低温的每只大鼠最低有效剂量的苯巴比妥钠，以防止发抖。麻醉大鼠后，直视下气管插管术，所有大鼠均采用正压呼吸机通气[潮气量70～80 ml，呼吸频率（12～14）次/min，吸呼比2∶1]。在第4肋间行左胸垂直切口，打开心包露出心脏。心脏在闭塞前滴入0.5%的利多卡因。左前降支开口以远约2 mm处用5-0缝线结扎，用心电图观察术前、术后肢体导联ST段的变化，以ST段弓背向上抬高来确定手术成功，维持1 h后解开结扎，使心肌再灌注，关胸，全程心电图监测，并保存。

造模成功后，常温组大鼠给予尾静脉注射一定量的常温生理盐水1.0 ml/（min·kg），并置于毯子中，保持体温（36℃～38℃）;亚低温大鼠则可通过尾静脉输送4 ℃生理盐水1.0 ml/（min·kg），诱导亚低温状态，持续肛温测量，维持肛温32℃～36℃。

1.4 观察指标

1.4.1 心功能指标的测定  使用 Vevo770 型号超声仪（Visualsonics Inc，Canada），用17.5 MHz探头，采用M模块采集LVEF、HR和LVEDP数值，分别测出常温组及亚低温组3个心动周期的平均值。

1.4.2 SOD、MDA检测方法  留取每只大鼠左心室心尖部的心肌，以冰生理盐水进行冲洗，经差速离心法提取心肌匀浆蛋白，分别用于检测大鼠心肌细胞内SOD、MDA的含量。按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.3心肌细胞凋亡检测方法  实验方法具体采用TUNEL法，自结扎线下0.5 cm 处切取一小块心肌组织，将其置入10%多聚甲醛固定，24 h后行常规石蜡包埋、切片，贴附于其表面涂有多聚赖氨酸的载玻片上，检测心肌细胞凋亡率。按检验试剂包装盒的使用说明书规定执行。

于光镜下进行观察每个细胞核内部含有绿色荧光的细胞为凋亡细胞。每张细胞切片随机分别选取5个视野（×200），算出凋亡细胞和正常细胞的视野数量，得出AI。AI=视野中凋亡细胞数量/视野中细胞总数量×100%。

1.5统计学分析

各组数据采用SPSS 22.0软件处理，计量资料以（x±s）表示，采用One Way ANOVA对两组间的差异进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1两组大鼠左心功能指标变化情况比较

亚低温治疗组左心室射血分数（LVEF）明显高于常温组，差异有统计学意义（P<0.05）;而亚低温治疗组的心率（HR）和左室舒张末期压（LVEDP）明显低于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1   两组SD大鼠左心功能变化情况比较（x±s，n=20）

2.2两组大鼠心肌氧化应激损伤指标比较

亚低温治疗组心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）明显高于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;亚低温治疗组丙二醛（MDA）明显低于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2   两组大鼠氧化应激损伤指标比较（x±s，n=20）

2.3两组大鼠心肌细胞平均凋亡率变化比较

亚低温治疗组大鼠心肌细胞凋亡率为（17.63±1.98）%，明显低于常温对照组（28.86±2.97）%，差异有统计学意义（F=14.08，P<0.001）（图1）。

3 讨论

急性心肌梗死的抢救要求尽早开通闭塞冠脉，但是抢救过程中的缺血/再灌注损伤在所难免，所导致的心肌细胞氧化应激损伤、心肌顿抑、心肌细胞凋亡以及左心功能下降[4-5]，是影响病死率和预后的本质。大量文献证实，亚低温对机体组织的缺血/再灌注的保护作用已经在临床中被广泛应用[6-9]，如大面积脑梗死患者，经过溶栓或介入方法使脑血管再通，即可出现脑组织的缺血/再灌注损伤，亚低温治疗联合呋塞米可以达到脑保护的效果。而对于心脏骤停的患者，同样涉及到各个重要脏器的缺血/再灌注损伤，有研究中针对心脏骤停患者应用亚低温治疗，观察复苏后心肌、肾脏、肺脏等功能恢复情况及损伤程度评估，发现亚低温治疗确能对人体重要脏器发挥保护作用。吸取大量的应用亚低温治疗的临床和实验室经验，在本研究中针对亚低温对急性梗死心肌的保护机制进行观察，以心率、左室舒张末期压、左心室收缩功能、心肌细胞氧化应激损伤指标以及心肌细胞凋亡率为观察指标，探讨亚低温在急性心肌梗死治疗中对心肌的保护效果。

目前，氧化应激代谢激活被广泛公认是一种大脑神经组织缺血后功能恢复或出现大量血液供给后的脑损伤的主要代谢机制[10-11]，MDA是一种氧化应激代谢反应的最终代谢产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性，其含量能反映氧化应激程度。超氧化物歧化酶（SOD）也可以通过直接参与对氧自由基的激活清除，拮抗氧化应激，测量二者水平可间接觀察机体的氧化应激反应所致的细胞损伤程度[12]。另外，在缺血、缺氧及再灌注过程中心肌细胞不仅出现大量的氧化应激损伤，还可能会导致心肌细胞发生凋亡[13-14]，主要位于心肌梗死边缘地带。而心肌细胞的氧化应激反应及细胞凋亡直接影响预后和心功能。所以，在本次诱导亚低温治疗急性心肌梗死的动物实验研究中，将心率（HR）、左室舒张末期压（LVEDP）、左心室射血分数（LVEF）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、细胞凋亡率设定为两组SD大鼠急性心肌梗死治疗中的重要观察指标，结果显示亚低温治疗组LVEF明显高于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明亚低温治疗可以改善急性心肌梗死大鼠的左室心功能。而HR、LVEDP均明显低于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明亚低温治疗可以降低心室率，阻止交感神经兴奋的代偿反应，从而降低心肌耗氧量，并改善左室舒张末期压力。亚低温治疗组SOD（U/L）明显高于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且MDA（mmol/L）明显低于常温对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明亚低温治疗组相比对照组有更强的氧自由基的激活清除能力和拮抗氧化应激的能力;氧化应激代谢反应的最终代谢产物MDA值低于对照组，说明亚低温治疗相比对照组可以减少氧化应激损伤的最终代谢产物生成。另外，本项研究结果中证实亚低温组细胞凋亡率明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），说明亚低温治疗方法可以有效干预急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌细胞的凋亡率。

综上所述，在SD大鼠的急性心肌梗死治疗中应用亚低温技术，可以降低心室率及左室舒张末期压力，提高左室射血分数，降低氧化应激损伤及心肌细胞凋亡的几率，以改善心肌梗死后心功能和预后。从而证实亚低温治疗可以对急性心肌梗死后的心肌产生明显的防御保护作用，且此种治疗措施简单易行，容易在临床中推广应用。

另外，缺血/再灌注可以引起线粒体微结构发生改变，而线粒体是真核细胞氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）的重要场所，主要承担着调控细胞能量代谢和凋亡通路的任务，同样，心肌细胞的氧化应激反应可以引起心肌细胞的损伤，甚至心肌细胞凋亡。下一步将进行亚低温治疗对线粒体结构和功能的影响，以及亚低温与心肌细胞凋亡的信号通路及相关凋亡蛋白的关系。本项研究为其打下坚实的基础，提供基础实验数据，最终期望能阻止心肌细胞缺血/再灌注的损伤通路，使急性心肌梗死患者获益，为临床急性心肌梗死患者的治疗提供更多的、科学的实验依据。

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（收稿日期：2021-11-06）