镇咳宁口服液质量标准提高研究*

许丁香，谭智艳，李仁玮，齐 皓

（1. 湘南学院附属医院药剂科，湖南 郴州 423000； 2. 湖南省郴州市食品药品检验检测中心生化药理室，湖南 郴州 423600）

镇咳宁口服液由桔梗、枳实、陈皮、远志、白前、法半夏、紫菀、甘草、百部等14味中药材组方，为湖南省郴州市安仁县人民医院院内制剂，临床应用10余年，主要用于治疗感冒引起的咳嗽。其现行质量标准主要是对桔梗、甘草、远志3 种药材及其中主要化学成分橙皮苷进行定性鉴别。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中枳实、百部2 种药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定橙皮苷的含量，以期为镇咳宁口服液质量标准的提高提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括紫外检测器、Chemstation 工作站（美国Agilent 公司）；XSE250DU 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA5003型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KQ3200DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

镇咳宁口服液（湖南省郴州市安仁县人民医院，批号分别为20180907，20181109，20181212，规格为每支10 mL）；枳实对照药材（批号120936-201606）、百部对照药材（批号121221 - 201604）、橙皮苷对照品（批号110721 - 201818，含量96.2%），均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、冰醋酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

枳实［1-2］：取样品20 mL，加三氯甲烷40 mL，超声（功率为250 W，频率为40 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液蒸干后加无水乙醇1 mL 使溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取枳实对照药材1 g，加三氯甲烷20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干后加无水乙醇1 mL 使溶解，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。按镇咳宁口服液处方和工艺制备缺枳实的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》TLC法，吸取上述溶液各10 μL［3］，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯- 丙酮- 冰醋酸（15∶1∶0.5，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 mm）下检视［4］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

1. 阴性对照品溶液 2. 对照药材溶液 3-5. 供试品溶液图1 枳实薄层色谱图1.Negative reference solution 2.Reference medicinal material solution 3-5.Test solutionFig.1 TLC chromatograms of Aurantii Fructus Immaturus

百部［5］：取样品30 mL，加氨水溶液调pH 至10，用三氯甲烷萃取2 次（每次25 mL），合并有机相，蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。取百部对照药材2 g，用氨水溶液充分润湿，室温下放置10 min，加三氯甲烷20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干后加甲醇1 mL使溶解，即得对照药材溶液。按镇咳宁口服液工艺处方制备缺百部的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》TLC法，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶5∶0.5，V/V/V）为展开剂，用饱和氨蒸气预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾稀溶液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2。

1. 对照药材溶液 2-4. 供试品溶液 5. 阴性对照品溶液图2 百部薄层色谱图1.Reference medicinal material solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionFig.2 TLC chromatograms of Stemonae Radix

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（35∶61∶4，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL［6-8］。

2.2.2 溶液制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含0.02 mg/mL橙皮苷的对照品溶液。精密量取样品5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声处理30 min后，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按镇咳宁口服液工艺和处方制备缺枳实、陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2.2 项下3 种溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液与对照品溶液色谱峰相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图3。

线性关系考察：分别精密吸取2.2.2项下对照品溶液2，4，8，16，32，64 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.997 3X+1.077 3（R2=1.000，n=6）。结果表明，橙皮苷进样量在0.04 ～1.28 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2 项下对照品溶液适量，按2.2.1 项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.50%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，10，22 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD为1.10%（n=6），表明供试品溶液在室温放置22 h内基本稳定。

1. 橙皮苷A. 对照品溶液 B. 供试品溶液 C. 阴性对照品溶液图3 高效液相色谱图1.HesperidinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

重复性试验：取样品（批号为20181212）适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，共6 份，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.70%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为20181212）5 mL，精密称定，共6份，分别精密加入橙皮苷对照品溶液适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取3 批样品，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，平行3 次，记录峰面积，并计算样品含量。结果批号为20180907，20181109，20181212 的样品中橙皮苷含量分别为0.274 1，0.274 9，0.273 5 mg/ mL，RSD分别为0.4%，0.8%，0.4%。

3 讨论

本制剂现行质量标准主要为定性鉴别，未涉及定量内容。镇咳宁口服液由14味中药组方，现行标准可鉴别药材数量过少，且缺少阴性对照试验验证。

TLC法在单味中药、中成药及中药相关制剂的鉴定中应用广泛，且操作简单、准确度高。HPLC 法因其高压、高效、高灵敏度等特点，成为中药关键物质定量测定首选方法。因此，本研究中结合TLC 法及HPLC 法对镇咳宁口服液进行质量标准研究。橙皮苷为二氢黄酮苷化合物，易溶于吡啶及氢氧化钠溶液，微溶于甲醇，且吡啶属2B类致癌物，氢氧化钠不能应用于色谱，故选用甲醇。本研究中参考相关文献和大量试验研究对原TLC 法进行了验证和修订，解决了阴性干扰问题，并保证了试验的可重复性［9-12］。此外，本研究中还建立了枳实和百部的TLC 鉴别方法，该方法具有良好的重复性和特异性。橙皮苷存在于陈皮和枳实中，故以该成分作为含量指标。在预试验中考察了不同的流动相，结果以甲醇-水-冰醋酸（35∶61∶4，V/V/V）为流动相，分辨率最佳，无干扰，适用于橙皮苷的含量测定。

综上所述，本研究中建立的方法操作简单，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于提高镇咳宁口服液的质量标准。