植物-耐铅微生物联合修复铅污染土壤研究

姚洁,鲍立宁，姜宇,朱曙光,

(1.安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.安徽建筑大学 水污染控制与废水资源化安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601；3.安徽建筑大学 安徽省绿色建筑先进技术研究院，安徽 合肥 230601；)

重金属污染日益严重，直接或间接地影响了生态系统和人类的生命健康。重金属在土壤中的隐蔽性、潜伏性、长期性等特点，使其成为环境污染防治的重点和难点。生物修复技术作为新时期科技发展的产物，利用植物、微生物的生命代谢活动来减少环境中的有害物质浓度，使被污染的环境能够部分或完全恢复初始状态[1]。目前生物修复技术主要包括植物修复、微生物修复和植物-微生物联合修复三个方面。植物修复是利用超积累植物对土壤中的重金属进行提取、吸收、转化和固定等，在修复的同时改善生态环境[2]。微生物修复是通过细菌、真菌、藻类等微生物对土壤中的重金属进行吸附与转化[3]。植物-微生物联合修复是在单一植物修复基础上，将与植物共生或非共生微生物联合起来，形成联合修复体对受重金属污染土壤进行修复，从而减轻土壤的重金属污染[4-5]。植物-微生物联合修复是目前生物修复重金属污染土壤的一种有效方法。张胜爽[6]通过试验发现黑麦草与拟青霉菌、嗜麦芽窄食单胞菌联合作用，可以修复被重金属污染的耕地土壤,黑麦草对铅的富集主要集中在根部,种植接种菌株的黑麦草可达到修复土壤污染的目的。江春玉等[7]从土壤样品中筛选出一株铅镉抗性细菌，接种该菌株能使印度芥菜和油菜的生物量及植株内的铅镉总含量均显著增加。通过接种重金属抗性菌株，增强了不同植物对重金属的富集作用，证明了植物与重金属抗性菌株联合作用可以降低土壤中重金属的含量，减少土壤重金属污染。

选取袖珍椰子和凤尾蕨两种景观植物分别与寡养单胞菌属(Stenotrophomonaspavanii)协同修复重金属铅污染的土壤，研究袖珍椰子和凤尾蕨两种植物的株高、叶绿素、重金属铅含量和酶活。根据结果分析植物—耐铅微生物联合修复对土壤中铅去除效果的影响，试图进一步发现植物在联合修复体系中所起的作用，为今后研究植物—微生物联合修复土壤重金属污染提供技术支撑与积累。

1 材料与方法

1.1 供试细菌、植物及土壤

试验菌株筛选样品采自某工厂处理水的剩余污泥，从污泥样品中用含铅培养基筛选出多株微生物菌株，经筛选鉴定后最终选出一株抗性最好的菌株，为寡养单胞菌属，文中该菌株用W表示[8]。

供试植物选取袖珍椰子(ChamaedoreaelegansMart)和凤尾蕨(PteriscreticaL.var.nervosa)，均购自合肥花鸟市场。试验土壤为安徽建筑大学南校区绿化土壤，土壤基本理化参数为：pH值为7.32，有机质含量为6.43 %，总氮浓度为405.41 mg/kg，速效磷浓度为10.33 mg/kg、速效钾浓度为26.67 mg/kg，重金属铅浓度为0.113 mg/kg。

1.2 试验设计

称取Pb(NO3)2溶于蒸馏水，制备Pb2+浓度分别为0、200、400、800、1 500、2 000 mg/L的溶液。在30 d内分别用500 mL不同浓度的Pb溶液每3 d浇灌一次试验土壤，各浓度土壤充分混合后老化30 d。盆栽试验设计采用同上6种浓度梯度的Pb溶液，将长势一致的袖珍椰子和凤尾蕨分别栽种至不同Pb浓度的花盆中，每一浓度均设置平行样。每种植物在不同浓度下的试验均设计不接种菌株的空白对照组和接种W菌株的试验组，接种菌株采用接触生长法，将制备好的相同浓度的菌液投加到相应的不同铅浓度花盆的植物根系附近[9]，每隔7 d用Hoagland营养液浇灌一次，待植物生长60 d后，取其进行相关指标测定。

1.3 植物生理指标、铅含量及酶活的测定试验

1.3.1 植物生物量测定

待植物生长60 d后，将其从不同Pb2+浓度的盆中连根挖出。在离子水将植物洗涤干净后，用吸水纸将水分充分吸干，量出袖珍椰子和凤尾蕨在不同浓度下的株高，判断其生长情况。

1.3.2 植物叶绿素测定

剪取植物叶片中间部分，称0.25 g叶片，加蒸馏水研磨。吸取研磨匀浆加蒸馏水至体积为5 mL。吸取1 mL样品，加丙酮4 mL，离心机离心(6 000 r/min，10 min)，取上清液。以80%丙酮作为空白对照，分别测OD663和OD645，按下列公式计算植物叶片中叶绿素含量[10]：

Ca=12.72×OD663-2.59×OD645，

Cb=22.88×OD645-4.67×OD663，

C总=Ca+Cb=8.05×OD663+20.29×OD645,

其中:Ca为叶绿素a的含量;Cb为叶绿素b的含量;C总为叶绿素的总含量。

1.3.3 植物铅含量测定

植物体内Pb2+含量的测定采用硝酸-高氯酸消解法，将植物样品在160 ℃下用密闭的聚四氟乙烯罐消煮至澄清。消煮后的溶液用稀硝酸洗至容量瓶中并用蒸馏水定容至100 mL，样品液经稀释过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪(Optima 8 000，Perkinlimer)测定Pb2+浓度[11]。

1.3.4 植物酶活测定

植物过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法进行测定[12]，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚比色法[12]进行测定，植物超氧化物歧化酶(SOD)采用氯化硝基四氮唑蓝光化还原法[12]进行测定，对各指标进行三次测定后取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 不同Pb2+浓度处理下接种W菌株对植物株高的影响

土壤中重金属铅污染胁迫对植物的影响最直观地表现在植物生长指标上。在不同铅浓度胁迫下分别测定袖珍椰子和凤尾蕨的株高，结果如图1所示。

(a)袖珍椰子株高

60 d生长周期后，在低铅浓度(0～400 mg/L)时袖珍椰子和凤尾蕨的株高均有所增加，而在Pb2+浓度超过400 mg/L时其株高逐渐减少。袖珍椰子和凤尾蕨对铅具有一定的耐受性，但超过一定程度，会抑制植物的生长。当土壤中铅浓度较高时，植物根系吸收土壤中的铅，Pb2+以沉淀和络合物形式存在，当植物体内的Pb2+到达临界状态后，高浓度铅会对植物产生一定的毒害作用，进而抑制了植物生长。

与空白对照组相比，接种W菌株提高了两种植物的株高，对植物的生长具有一定的促进作用。在0～800 mg/L的Pb2+浓度下，袖珍椰子的株高明显高于对照组，在Pb2+浓度为200～400 mg/L时，株高分别增加了3.31%、2.77%。凤尾蕨接W菌后在Pb2+浓度为0～200 mg/L时其株高分别增加了3.32%、2.53%，由此可以得出，在Pb2+胁迫作用下，接种W菌株的袖珍椰子和凤尾蕨的生长指标受到重金属铅的毒害作用会降低，但接种W菌株促进植物生长的最优条件不同，接菌对袖珍椰子的促进作用较凤尾蕨更明显。

2.2 不同Pb2+浓度处理下接种W菌株对植物叶绿素影响

植物叶绿素是反映植物吸收、转化营养元素的重要指标。植物接种W菌株后，不同铅浓度的胁迫对植物叶绿素的影响不同。由图2可知，随着土壤Pb2+浓度的增加，两种植物的叶绿素含量均先上升后下降，说明袖珍椰子和凤尾蕨在低浓度(0～400 mg/L)范围通过植物体内自我保护系统能减少重金属Pb毒害作用，但超过这个浓度范围植物的自我保护系统就可能减弱。

(a)袖珍椰子叶绿素

接种W菌株后的袖珍椰子和凤尾蕨在不同Pb2+浓度下，植物叶片中叶绿素含量明显高于不接菌的对照组。接菌后，袖珍椰子在Pb2+浓度为400 mg/L时,其叶片中叶绿素含量比空白组高5.91%，凤尾蕨在Pb2+浓度为0 mg/L时,其叶片中叶绿素含量比空白组高3.97 %，与凤尾蕨相比接种W菌株对袖珍椰子的促进作用更明显。通过对植物叶片叶绿素含量分析得出，接种W菌株增加了袖珍椰子和凤尾蕨叶片的叶绿素含量，有利于植物光合作用。

2.3 不同Pb2+浓度下接种W菌株对植物重金属Pb含量的影响

将袖珍椰子和凤尾蕨在不同Pb2+浓度下进行胁迫处理，经60 d的周期培养后，植物地上和地下部分的Pb含量如图3、图4所示。

(a)地上部分铅含量

(a)地上部分铅含量

随着土壤中Pb2+浓度增加，袖珍椰子和凤尾蕨地上和地下部分的Pb含量均逐渐增加，说明两种植物对Pb有明显的吸收。在相同Pb2+浓度胁迫下，袖珍椰子和凤尾蕨的地下部分Pb浓度均明显高于地上部分，说明根部是袖珍椰子和凤尾蕨富集重金属Pb的主要器官。植物地下部分铅浓度较高，其原因可能是由于根部细胞对Pb的富集，不断积聚Pb2+，进行金属离子的络合和其他配位反应，使重金属的移动性能降低，进一步抑制Pb转移至地上部分，从而缓解Pb胁迫的毒害[13]。

接种W菌株后与对照组相比，袖珍椰子和凤尾蕨的地上部分在Pb2+浓度为2 000 mg/L时铅含量分别增加了112.61%和12.87%，地下部分在Pb2+浓度为200 mg/L时铅含量分别增加了108.99 %和113.01 %，说明在高铅浓度(800～2 000 mg/L)环境下接种W菌株促进了袖珍椰子地上部分对Pb的富集，而二者的根系均在低铅环境(0～400 mg/L)中对铅的吸收能力更好。与对照组相比，接种W菌株加强了袖珍椰子和凤尾蕨对铅的富集，在耐铅微生物作用下促进了植物对重金属Pb的吸收，加强了袖珍椰子和凤尾蕨的呼吸作用，有利于促进植物对重金属的富集，增强了植物的耐受性。

2.4 不同Pb2+浓度处理下接种W菌株对植物酶活影响

CAT酶又称触酶，是植物中最重要的抗氧化酶之一，能催化细胞内过氧化氢发生反应，以降低植物细胞受到过氧化氢的危害，抑制植物细胞膜脂质过氧化[14]。从图5明显看出，随着土壤中Pb2+浓度的增加，袖珍椰子和凤尾蕨的CAT酶活性先上升后下降，其中空白对照组的袖珍椰子CAT酶活性在800 mg/L铅浓度时酶活明显下降。在未接种菌株的对照组中，在铅浓度为400～2 000 mg/L时袖珍椰子CAT酶活比凤尾蕨CAT酶活的耐铅能力更好。

(a)袖珍椰子CAT酶活

对比空白对照和接种菌株后的植物CAT酶活，可以看出接种菌株后其酶活总体上较对照组有增加，尤其凤尾蕨接菌后在800～2 000 mg/L CAT酶活性显著增加。当Pb2+浓度为200 mg/L时，袖珍椰子、凤尾蕨的CAT酶活性均达到最大值，约为对照组的1.33 倍和1.03 倍，说明在重金属铅的胁迫反应中接种菌株增强了植物的CAT酶活性，对植物生长有一定促进作用。

植物在高浓度范围出现CAT酶活性降低的现象，可能是植物在低浓度铅(0～400 mg/L)时对Pb的耐受性较好，高浓度铅(800～2 000 mg/L)胁迫会造成植物体内的多种功能膜及酶系统受到一定程度的破坏，影响植物的正常生长。不同浓度对二者的促进作用不同，接种W菌株后袖珍椰子在低铅浓度时CAT酶活性较对照组明显增加而凤尾蕨则是在高浓度铅时酶活增加最明显。

POD酶是植物体内的一种氧化还原酶，在抑制植物细胞膜脂质过氧化、清除超氧自由基和减少活性氧伤害等方面发挥着重要作用[14]。从图6看出，随着土壤中Pb2+浓度的增加，接W菌后的袖珍椰子和凤尾蕨中POD酶活性先升高后下降。与对照组相比,接种W菌株增强了植物POD酶的活性，接菌后袖珍椰子POD酶活性在Pb2+浓度为800 mg/L时到达了酶活性的最大值，约为对照组的1.07 倍。接菌后的凤尾蕨POD酶活性Pb2+浓度为400 mg/L时达到了酶活性的最大值，约为对照组的2.64 倍,其原因可能是高浓度(800～2 000 mg/L)Pb胁迫会使植物体内的酶系统受到一定程度的破坏，影响植物的正常生长。接种W菌株后在低铅浓度时凤尾蕨POD酶活性的促进作用比袖珍椰子明显，袖珍椰子在高铅浓度时接种菌株的促进作用更显著。

(a)袖珍椰子POD酶活

SOD酶是存在于植物体内起关键作用的一种防御酶，能减少氧自由基，在植物细胞受氧化伤害方面起重要保护作用[14]。由图7可知，随着Pb2+浓度的升高，袖珍椰子和凤尾蕨的SOD酶活性一直持续下降且下降速度较快，其原因可能是重金属铅胁迫对植物SOD酶活性有较强的抑制作用，Pb2+在植物体内不断累积导致了大量的自由基产生，自由基的积累水平超过了SOD的清除能力，植物的SOD酶活性受到一定影响。

(a)袖珍椰子SOD酶活

袖珍椰子接种W菌株在Pb2+浓度为400 mg/L时SOD酶活性较对照组明显提高，约为对照组的1.53倍。而凤尾蕨在整个铅胁迫过程中其SOD酶活均高于对照组，凤尾蕨在Pb2+浓度为800 mg/L时SOD酶活性约为对照组的1.09倍。接种W菌株明显促进了凤尾蕨的SOD酶活性，袖珍椰子接种W菌株后其SOD酶活在Pb2+浓度为0～400 mg/L时明显提高。

在铅胁迫条件下，W菌株与植物联合修复，提高了植物CAT酶、POD酶及SOD酶的活性，减轻了铅胁迫的毒害作用，增强了植物对铅的耐受性。但植物的种类和Pb2+浓度的不同，接种耐铅微生物对植物酶活的促进效应也不相同。在所有植物酶活试验处理中，与对照组相比接种耐铅菌株在低铅浓度时袖珍椰子CAT、凤尾蕨的POD酶活、袖珍椰子SOD酶活明显增加；而在高浓度铅环境下凤尾蕨CAT酶活、袖珍椰子POD酶活、凤尾蕨SOD酶活增加更明显。

在重金属Pb的胁迫下，耐铅微生物与植物联合修复重金属铅污染土壤，结果表明：通过耐铅微生物和植物的协同修复机制，强化了微生物在植物中的作用，微生物可通过自身作用吸收Pb2+，降低了土壤中重金属Pb的毒害程度，从而对植物生长起到促生作用，植物抵抗重金属Pb毒害的同时也提高了微生物的抗重金属能力，促进了袖珍椰子和凤尾蕨的生长[15-16]；另一方面,接种耐铅微生物对重金属Pb污染土壤的修复有一定的促进作用，微生物在植物—耐铅微生物联合修复的过程中发挥重要作用，产生了有机酸，活化了土壤中的Pb2+，增强了植物的酶活[17];同时,微生物代谢过程中会分泌物如有机酸、铁载体、表面活性剂、螯合剂等可改变土壤中重金属Pb的存在形态，富集土壤中的营养物质，促进袖珍椰子和凤尾蕨的生长和对重金属Pb2+的吸收和转运，进而提高了联合修复对重金属铅污染土壤的修复效率[15-17]。

3 结论

试验研究了植物—耐铅微生物联合修复重金属铅污染土壤的效果，结果表明接种耐铅微生物缓解了重金属Pb对植物的毒害作用，利用植物的提取作用将重金属Pb大量积累在植物根部，降低了土壤中重金属Pb对植物的毒害程度,具体试验结论如下：

1)未接种耐铅微生物的袖珍椰子和凤尾蕨随着土壤中Pb2+浓度的增加，其株高的变化趋势为先增加后下降，说明高浓度铅抑制了植物的生长。在Pb2+胁迫作用下，接种耐铅菌株均提高了袖珍椰子和凤尾蕨的株高，促进了袖珍椰子和凤尾蕨的生长，其对袖珍椰子的促进作用更明显。植物生长受Pb胁迫的影响降低，接种菌株后其代谢与生存改善了土壤内部环境，有利于袖珍椰子和凤尾蕨在铅胁迫环境下进行光合作用。

2)袖珍椰子和凤尾蕨在经历60 d的生长周期后由于根部细胞不断积聚Pb2+，进行金属离子的络合和其他配位反应，使Pb的移动性能降低，抑制了Pb从植物根际转移至地上部分，从而缓解Pb胁迫对植物的毒害。接种耐铅微生物均促进了袖珍椰子和凤尾蕨对土壤中重金属铅的富集作用，由于微生物的代谢活动，增加了植物对Pb的耐受能力，促进植物的生长。

3)在铅胁迫条件下，通过耐铅微生物的作用增强了袖珍椰子和凤尾蕨的CAT酶、POD酶及SOD酶活性，减轻了铅胁迫对植物的毒害作用，增强了植物对铅的耐受性。植物酶活性与植物的种类、铅的胁迫程度有关，不同植物对Pb的耐受性存在差异，同种植物对不同程度Pb胁迫的反应机制也不相同。所有植物酶活实验处理中，与对照组比较在低铅浓度环境下接种耐铅菌株对凤尾蕨的POD酶活、袖珍椰子的CAT和SOD酶活的促进效果明显；而在高浓度铅环境下接种菌株对袖珍椰子的POD酶活、凤尾蕨CAT和SOD酶活的增加更明显。