微生物遗传分析的教学探讨

江转转，许 远，宋亚玲

遗传学的研究内容主要有三大部分：遗传、变异、进化.遗传是变异的基础，变异是遗传的发展，遗传与变异共同推动着物种的进化.遗传指的是亲代与子代之间的相似，而变异指的是亲代与子代之间的差异[1-3］.导致生物体发生性状变异的原因有多种，如基因突变、基因重组、染色体结构变异、染色体数目变异，等等.其中基因重组是基于两个DNA 片段之间的交叉互换而带来的性状重新组合.在遗传学中，通过计算两个基因间发生重组的概率来估计两个基因间的距离，称为遗传分析或者遗传作图.在高等动植物中，可通过“两点测验”即一次杂交和一次测交确定两个基因间的距离或“三点测验”即一次杂交和一次测交确定三个基因间的距离来进行遗传分析[4］.与高等动植物不同，微生物结构较为简单，多数进行无性生殖，其基因重组及遗传分析方式也较为特殊，无典型的杂交与测交，学生在学习时会存在很多的误区，并且会将高等动植物遗传分析的方法简单套用在微生物遗传分析上.为了明确不同微生物基因重组的实质，分析不同微生物基因重组的特点，改良各自遗传分析的方法，本文以三种典型的微生物（粗糙脉孢霉、噬菌体、枯草杆菌）为例，以基因重组形式为主线，探讨并剖析不同类型微生物遗传分析方式及其基因重组的本质，帮助生物学专业学生在遗传分析中厘清差异，弄清实质，举一反三.

1 粗糙脉孢霉的基因重组及遗传分析

粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）是一种比较常见的真菌，其体积小，易繁殖，同时可进行有性生殖与无性生殖，常作为遗传学研究材料[4-5］.一般情况下，粗糙脉孢霉在进行有性生殖时会发生基因重组.粗糙脉孢霉的有性生殖发生在两种不同类型的单倍体菌丝体之间（定义为“+”和“-”）.单倍体菌丝体产生的分生孢子染色体数为7，两种不同交配型的分生孢子发生核融合，形成染色体数为14 的合子，合子经减数分裂与有丝分裂后形成8 个子囊孢子.因子囊太过狭窄，子囊孢子只能按照既定的顺序排列在子囊中，称为顺序四分子（图1）.

图1 粗糙脉孢霉的有性生殖过程示意图

粗糙脉孢霉的基因重组常发生在有性生殖的减数分裂时期，这与高等动植物一致.遗传上可通过子囊孢子的排列顺序来判断同源染色体间是否发生基因重组，称为四分子分析.若来自同一染色体的两条姐妹染色单体呈相邻排列，则认为没有发生重组或发生了偶数次的重组，若来自同一染色体的两条姐妹染色单体呈交叉排列，则认为发生了奇数次的重组（图2）.多数遗传学教材用如下公式来估算粗糙脉孢霉基因的重组率：

图2 粗糙脉孢霉基因重组示意图

然而，多次的教学反馈结果显示，大部分学生无法理解计算公式中乘以二分之一的原因，部分学生甚至认为减数分裂后的有丝分裂扩大了重组率，因而要乘以二分之一.为了更正学生的误区，笔者将上述公式做了如下变形，便于学生理解.

从图2 可以看出，单交换可产生重组型子囊孢子，在交换型子囊里有一半是重组型子囊孢子，因此一个交换型子囊中有4 个重组型子囊孢子，4 个非重组型子囊孢子.而不论是交换型子囊还是非交换型子囊，均包含8 个子囊孢子.因此教材公式中的二分之一来源于分子与分母中数字的比值.

2 噬菌体的基因重组与遗传分析

噬菌体是一类以细菌为寄主的病毒，其结构较为简单，仅包含环状DNA 遗传物质及蛋白质外壳[6-7］.噬菌体的遗传基因重组发生在侵染细菌阶段.如图3 所示，两类不同的噬菌体h-r+与h+r-（h，host range mutant，宿主范围突变型；r，rapid lysis，速溶性）侵染同一宿主，将自身的遗传物质DNA 注入宿主细胞，并降解宿主DNA.在宿主细胞内，同源区段发生交叉重组，此过程类似于真核生物中的非姐妹染色单体交叉互换.同源区段的基因重组完成后会产生两种数量相当的重组型（h-r-与h+r+），因此转化后会出现四种不同类型的噬菌斑（h-r+、h+r-、h-r-与h+r+），因此计算交换值时只需将重组型噬菌斑数（h-r-与h+r+）除以总的噬菌斑数即可，公式如下：

图3 噬菌体基因重组示意图

在某些情况下，两种重组型噬菌斑只有一种能够被检出，在计算交换值时，将检出的重组型噬菌斑数量加倍后再除以总的噬菌斑数以估算交换值.

3 枯草杆菌的基因重组与遗传分析

与粗糙脉孢霉及噬菌体不同，细菌的基因重组发生在线性DNA 片段与环形DNA 之间，现以黎德伯格的枯草杆菌（Bacillus subtilis）转化实验说明细菌基因重组的过程及遗传分析方法.枯草杆菌可以通过其细胞膜摄取环境中的游离DNA 片段，称为供体DNA，枯草杆菌自身的环状DNA 则称为受体DNA.供体DNA的基因型为色氨酸、组氨酸、络氨酸野生型（trp2+his2+tyr1+，+++），受体DNA 为色氨酸、组氨酸、络氨酸营养缺陷型（trp2-his2-tyr1-，---）.供体DNA 在DNA 结合蛋白的协助下附着在受体细菌表面的受体位点上，核酸外切酶降解供体双链DNA 中的一条，另一条供体单链DNA进入受体细菌内.供体单链DNA 与受体双链环状DNA 在同源区段联会，重组并置换受体双链DNA 中的一条，形成供体-受体杂合DNA，而被置换的单链DNA 游离于细菌细胞中，不久会被降解.杂合DNA 复制后形成一个重组细胞和受体细胞（图4）.与粗糙脉孢霉及噬菌体不同，在细菌中仅偶数次交换有效，而奇数次交换无效.原因在于线性供体DNA 与环状受体DNA 若发生奇数次交换，则会导致环状受体DNA 开环，而开环DNA 在细菌细胞中易被降解.

图4 枯草杆菌基因重组流程示意图

黎德伯格的枯草杆菌转化实验是以trp2+his2+tyr1+为供体，trp2-his2-tyr1-为受体，用补充有不同营养物质的培养基进行重组细菌的遗传筛选，实验结果如表1 所示，共筛选出7种不同基因型的重组子，这七种重组子都来源于偶数次的交换，而trp2-his2-tyr1-在选择培养基上无法检出，即使在完全营养型培养基上检出也无法筛选出参与基因重组的数量，故在表中没有列出.从实验结果可以发现，等位基因型转化子数量上有巨大的差异，如-++//+--，存在有1 000 以上的数量差，如此巨大的数量差反映出在细菌的转化重组中，互为等位基因型的转化子不是在同一次转化中产生，这与细菌的转化过程一致即相反的重组子不存在.基于细菌转化重组的特殊性，笔者设计了如下的遗传分析方法：首先根据亲本基因型或重组基因型的数量推算出其等位基因型的数量，再依据数量的差异推算出不同的交换类型，并定义为交换型I、II、III.而后，可参照“三点测验”的计算方法来计算基因间的距离.如trp2与his2基因之间的距离为交换型I的比例加上交换型III的比例，为33厘摩，而his2与tyr1基因之间的距离为交换型II的比例加上交换型III的比例，为12厘摩（表2）.此种计算方式与教材中的计算结果相当，而且更容易理解，能达到前后贯通的效果.

表1trp2+his2+tyr1+（供体）×trp2-his2-tyr1-（受体）的转化子类型

表2trp2+his2+tyr1+（供体）×trp2-his2-tyr1-（受体）的重组率计算

4讨论

遗传学是研究基因间世代传递的规律，而微生物具有世代周期短、后代群体数量多的特点而备受遗传学家青睐[8］.粗糙脉孢霉、噬菌体以及枯草杆菌是其中最为典型的代表，各自的遗传分析方式既有相似也有差异.相似之处有以下两点：第一，均是统计单倍体的表型.如在粗糙脉孢霉的遗传分析中，统计的是不同表型的子囊孢子的数量而不是子囊的数量；在噬菌体中统计的是转染后不同表型的子代噬菌体的数量；在枯草杆菌中统计的是不同类型转化子的数量.而不论是子囊孢子或是子代噬菌体亦或是转化子本质上均是单倍体，即只拥有某物种的一套遗传物质.第二，有效重组均能在子代中显现.在单倍体中，所有基因的表型不会被掩盖，原因在于单倍体中的所有基因均无对应的等位基因，无论基因的显隐性在子代中均能得到反映[9］，基于此，只要发生有效的基因重组，那么在子代中均能得到显现.差异之处在于以下两点：第一，发生重组的DNA形式不同.在粗糙脉孢菌中，基因重组发生在两条线性DNA之间，若估算某一基因在基因组上的定位时可以借助着丝粒，把着丝点当作一个固定的位点，得到的重组率即为该基因与着丝粒之间的距离.并且，在此背景下，只有奇数次的交换有效而偶数次的交换无效，因为偶数次的交换不会产生有重组表型的子囊.在噬菌体中，重组发生在两个环状DNA之间.两个环状DNA之间若发生奇数次交换，则会发生融合，形成一个大的环状DNA；若发生偶数次交换则产生两个重组型的子代噬菌体.在枯草杆菌中，基因重组发生在单链线性供体DNA与双链环状DNA之间.在此背景下，只有偶数次的交换有效而奇数次的交换无效，因为奇数次的交换导致环状DNA开环，开环的双链DNA在细菌细胞中易被降解，无法传递至下一代.第二，遗传分析方式不同.在粗糙脉孢霉中，因每一子囊中只有一半的孢子发生重组，因此在以子囊数为统计对象进行遗传分析时，得到的重组率需除以二分之一，否则会使重组率偏大.噬菌体基因重组率的遗传分析与高等植物中的三点测验方式一致，即通过不同基因型的数量判断交换类型，计算出每种交换类型的数量来标定基因间的顺序和距离.而枯草杆菌的遗传分析方式更为特殊，需根据某一基因型子代的数量推断出其等位基因型子代的数量再参照三点测验的方式进行基因重组率的计算.

综上，不同的微生物因其物种特异性或遗传方式特异性导致了遗传分析方法有所差异，但需要明确的是，任何物种发生基因重组的实质是相同的，即同源的基因片段发生交换，而重组值反映的是同源片段间交换的概率[10］.本文将三种典型微生物（粗糙脉孢菌、噬菌体、枯草杆菌）基因重组过程及遗传分析方式进行了细致地分析，且变形了粗糙脉孢菌遗传分析计算公式，开发了枯草杆菌另一遗传分析方式，比较了三种不同微生物遗传分析的异同及其本质，帮助生物学专业学生辨析差异，灵活运用，融会贯通.