沙苑子总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性研究*

莫小春, 胡德辉, 张 强, 丁世磊, 罗小莉

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus R.Br. )成熟的种子, 主要分布在我国陕西潼关、 内蒙古、 河北等省份为主的华北、 西北地区[1]。 沙苑子性温味甘, 具有的调血脂,养肝明目, 补肾助阳, 固精缩尿, 降血脂, 提高免疫力的功效[2-3], 它不仅是中药材市场上的大宗药材, 现在已成为中老年人青睐的保健品[4], 例如: 将沙苑子作为“茶饮” 品尝, 制作与沙苑子相关的沙苑子酒、 沙苑子糖等特色食品。 相关研究表明, 沙苑子中富含的黄酮成分, 对高脂血症患者具有很好的调节血脂代谢的作用, 抗肿瘤、 抗氧化等显著的药理作用[5-7]。因此, 提高沙苑子总黄酮得率是非常必要的。

当前, 沙苑子总黄酮的提取工艺主要有溶媒浸提[8-9]、 超声波[10-12]、 超临界CO2流体萃取[13]等, 例如: 李君玲[8]报道沙苑子总黄酮的乙醇提法, 得到黄酮含量为13.58 mg/g; 刘银芳等[9]考察了提取溶媒对沙苑子总黄酮的影响, 提出乙醇为最优提取溶媒, 总黄酮量为5.13 mg/g; 李洪娟等[10]介绍了超声波提取法, 乙醇为提取溶液, 总黄酮含量约为6 ～10 mg/g; 张清安等使用超声法, 分别选择了丙酮和甲醇作为提取溶剂, 得到黄酮含量分别为161.98 mg/g、 106.64 mg/g[11-12]; 谢小霞等[13]研究了超临界CO2流体萃取法, 总黄酮提取率为0.78%。综上, 微波-超声波相结合方法鲜有报道用于沙苑子总黄酮提取工艺中, 但已被应用在不同的原料黄酮化合物的提取工艺研究之中, 可有效提高天然产物的得率、 缩短提取时间, 减低成本[14]。

因此, 本研究将结合微波和超声波方法, 通过响应面Box-Benhnken 设计优选出沙苑子总黄酮的最佳提取工艺, 旨在提高沙苑子总黄酮的得率, 降低成本, 简化生产操作, 评价该药材的抗氧化活性, 为沙苑子总黄酮的提取工艺革新及应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

沙苑子, 南宁生源中药饮片有限责任公司; 芦丁标准品,中国食品药物检定研究院(纯度≥99%); 1,2-二苦基-2-三硝基苯亚肼, 梯希爱化成工业发展有限公司(纯度＞97%); 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚, 天津化学试剂有限公司; 三氯化铝、醋酸钠、 甲醇、 无水乙醇、 石油醚(沸点60 ～90 ℃), 国药集团化学试剂有限公司; 均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

UV-2600 紫外可见分光光度计, 岛津仪器有限公司;FW100 高速万能粉碎机, 天津市泰斯特仪器有限公司; PS-40A 超声波清洗机, 深圳市科洁超声有限公司; M3-L235F 微波炉, 广东美的厨房电器制造有限公司; SQP 电子分析天平,赛多利斯科学仪器北京有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 样品的制备

将250 g 沙苑子粉碎过筛, 石油醚加热回流4 h, 趁热过滤, 脱脂药粉自然挥干, 真空干燥4 h, 收集备用。

1.3.2 最大吸收波长的确定

精密称取芦丁标准品20.20 mg, 用65%乙醇定容至100 mL得0.2020 mg/mL 的芦丁母液, 精密移取2.00 mL 于25 mL 的棕色容量瓶中, 采用三氯化铝-醋酸钠显色法, 依次加入4.00 mL 65%乙醇, 2.00 mL 0.1 mol/L 三氯化铝水溶液, 3.00 mL 1.0 mol/L 醋酸钠水溶液, 最后65% 乙醇定容, 摇匀, 静置15 min, 进行紫外吸收光谱测定, 确定410 nm 波长为吸收峰。

1.3.3 标准曲线的建立

分别精密移取1.3.2 准备的芦丁母液1.00 mL、 2.00 mL、3.00 mL、 4.00 mL、 5.00 mL、 6.00 mL 于25 mL 的棕色容量瓶中, 采用三氯化铝-醋酸钠显色法, 依次加入4.00 mL 65%乙醇, 2.00 mL 0.1 mol/L 三氯化铝水溶液, 3.00 mL 1.0 mol/L醋酸钠水溶液, 最后65%乙醇定容, 摇匀, 静置15 min, 在410 nm 波长处测吸光值, 绘制芦丁的标准曲线。

1.3.4 沙苑子总黄酮的提取

按1.3.2 显色法测定沙苑子样品提取液的吸光度, 将所得的吸光值代入芦丁标准曲线, 计算得到提取物中总黄酮含量,并按下面的公式计算总黄酮的得率。

式中: Y 为样品中总黄酮得率,%; C 为由所测吸光度值代入芦丁标准曲线后得出的黄酮的质量浓度, mg/mL; V1为稀释体积, mL; V2为样品溶液的体积, mL; m 为样品质量, mg;V3为取样体积, mL。

1.3.5 沙苑子总黄酮提取单因素的探索

称取沙苑子粉末0.5 g, 加入乙醇浸泡, 分别考察乙醇浓度(45%、 55%、 65%、 75%、 85%), 微波时间(30 s、 60 s、120 s、 150 s、 180 s), 微 波 功 率(90 W、 270 W、 450 W、720 W、 900 W)和超声时间(10 min、 20 min、 30 min、 40 min、50 min、 60 min)对黄酮得率的影响。

1.4 统计学分析

根据单因素试验的结果的水平范围, 选择影响效果显著的乙醇浓度(%)、 微波时间(s)、 超声时间(min)为优化因素,沙苑子总黄酮得率(Y)为评价值, 利用Design-Expert 10.0 进行Box-Behnken 试验设计, 并进行响应面分析。

1.5 抗氧化试验

将最优条件下得到的沙苑子总黄酮提取液, 参照赵二劳文献的方法[15], 各取0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00,3.50, 4.00, 4.50, 5.00 mL 于10.00 mL 的容量瓶中, 配制成不同浓度的样品溶液, 再取样品溶液与0.13 mg/mL DPPH 溶液等体积混合, 在室温避光处静置30 min; 用无水乙醇作为参比溶液, 在517 nm 处测定吸光度A; 不同浓度的样品溶液与无水乙醇等体积混合避光处放置30 min, 在517 nm 处测定吸光度A空白; DPPH 溶液与无水乙醇等体积混合避光处放置30 min,在517 nm 处测定吸光度ADPPH; 平行测定3 次, 计算提取液对于DPPH 的清除率, 以BHT 为对照。

DPPH 自由基清除率=(1-(A-A空白))/ADPPH×100%

式中:A表示样品溶液的吸光度值;A空白表示空白组溶液吸光度值;ADPPH是DPPH 的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的建立

选取410 nm 为芦丁最大吸收波长, 然后以标准芦丁溶液质量浓度为横坐标、 吸光值为纵坐标绘制标准曲线, 得到线性回归方程为A= 29.6093C-0.0037(C代表浓度,A代表吸光度), 相关系数R2= 0.9999, 表明在0 ～0.04848 mg/mL 浓度范围内线性关系良好(图2)。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对沙苑子总黄酮得率的影响

探索乙醇浓度对沙苑子总黄酮得率的影响, 由图2 可知:当乙醇浓度在45% ～65%范围内, 总黄酮得率随着乙醇浓度的增大而增加, 当乙醇浓度为65%时, 总黄酮得率达到最大值;随着乙醇浓度继续增大, 黄酮得率出现下降趋势, 可能是此浓度下的有机溶剂极性与沙苑子中黄酮的极性相近, 使沙苑子细胞溶胀, 促进总黄酮成分的渗出[16], 乙醇浓度偏离65%越多,则沙苑子总黄酮的溶出量越少。 所以, 最终选择乙醇的浓度为65%。

图2 乙醇浓度对沙苑子总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.2 微波时间对沙苑子总黄酮得率的影响

微波时间对沙苑子总黄酮得率的影响见图3, 沙苑子总黄酮得率随着微波时间的增加呈现增加的趋势, 微波时间在120 s黄酮得率最大; 在120 s 之后得率逐渐下降。 推测是由于微波辐射可使细胞破碎, 从而增加黄酮的溶出量, 但是如果微波时间过久, 则会增加热量聚集, 破坏黄酮的结构, 导致黄酮的得率降低[17]。 所以选择微波的时间120 s。

图3 微波时间对沙苑子总黄酮得率的影响Fig.3 Effects of microwave time on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.3 微波功率对沙苑子总黄酮得率的影响

微波功率对沙苑子总黄酮得率的影响, 如图4 所示, 微波功率在90 ～900 W 之间, 沙苑子总黄酮的得率显示先递增后降低的趋势, 270 W 时达到最大值。 原因是随着微波功率递增,分子运动逐渐加剧, 黄酮析出逐渐增多; 而当继续增大微波的功率, 它产生的强烈作用使黄酮结构遭到破坏, 导致黄酮得率出现下降的趋势[18]。 故选择270 W 为较合适的微波功率。

图4 微波功率对沙苑子总黄酮得率的影响Fig.4 Effects of microwave power on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.4 超声时间对沙苑子总黄酮得率的影响

超声时间对沙苑子总黄酮得率的影响见图5, 在10 ～50 min 之间得率呈现逐渐上升的趋势, 在50 min 之后得率开始降低, 原因可能是超声波产生的能量与作用的时间有关, 超声时间越久, 其产生的能量就越大, 从而得率越高。 但是, 伴随着超声时间不断增加, 总黄酮的得率却出现下降的趋势, 最终使得总黄酮的得率减少。 所以选择超声的时间在50 min 时为最适合。

图5 超声时间对沙苑子总黄酮得率的影响Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.3 响应面试验结果

2.3.1 沙苑子总黄酮得率的响应面试验工艺设计表与结果

选择单因素为乙醇浓度(%)、 微波时间(s)和超声时间(min),确定各因素最佳水平值范围, 进行三因素三水平响应面试验设计, 试验因素与水平见表1; 采用Design-Expert 10.0 软件设计的Box-Behnken 试验, 分析方案与结果见表2。

表1 Box-Behnken 试验设计因素水平表Table 1 Design factor level table of Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken 设计方案和试验结果Table 2 Design scheme and test results of Box-Behnken

2.3.2 方差分析

利用Design-Expert 10.0 软件对表2 试验数据进行处理,得到沙苑子总黄酮得率对自变量乙醇浓度(A), 微波时间(B)和超声时间(C)二次多项式方程: Y=1.82-0.38A+0.015B+2.437×10-3C-0.025AB+0.047AC-0.037BC-0.29A2-0.073B2-0.13C2。

模型的显著性可根据失拟项F 值判断, F 值越大, 模型显著性检验相关系数P 越小, 表明相应的变量越显著。 由表3 可知, 该模型的极显著性(P ＜0.0001), 失拟项不显著(P ＞0.0807), 说明该回归模型与试验数据的拟合程度较高, 实验误差小, 模型有意义; 模型的一次项A, 二次项A2都具有极显著性, 表明乙醇浓度对沙苑子总黄酮的得率影响非常显著; 二次项C2具有显著性, 表明超声时间对沙苑子总黄酮得得率影响显著。 相关系数R2=0.9825、 校正决定系数RAdj=0.9601,说明该模型拟合状况良好, 建立的回归模型可信度高。 由响应面结果分析可得各因素对沙苑子总黄酮得率的影响大小依次为: 乙醇浓度＞超声时间＞微波时间。

表3 响应面回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface regression model

2.3.3 交互作用结果分析

由图6(a)分析可得: 乙醇浓度的坡面比微波时间的坡面陡峭, 说明乙醇浓度的二次项对总黄酮得率影响较大; 从图6(b)得到乙醇浓度和超声时间的二次项都对总黄酮得率有显著性, 但乙醇浓度影响较大; 同理, 图6(c)显示, 超声时间的二次项都对总黄酮得率有显著性, 微波时间影响显著性较弱。 其等高线的性状呈现出椭圆形, 椭圆形的等高线表明其相互效应较强,从而体现了乙醇浓度对于沙苑子总黄酮的得率的影响最为显著[19]。

图6 各变量交互作用对沙苑子总黄酮得率的影响Fig.6 Effects of the interaction of variables on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.4 抗氧化结果

沙苑子总黄酮成分对DPPH 的清除率效果如图8 所示。 在6.00 ～42.00 μg/mL 的范围内, 沙苑子总黄酮的提取液与BHT的无水乙醇溶液对DPPH 的清除率都会随着其浓度的增大而增大, 达到42.00 μg/mL 的浓度时, 沙苑子总黄酮的清除率达到89%, BHT 的清除率达到78%, 说明沙苑子总黄酮的DPPH 自由基清楚效果较好。 分别对沙苑子总黄酮与BHT 的清除率进行线性回归, 沙苑子总黄酮与BHT 对于DPPH 的IC50分别为14.68、 18.37 μg/mL, 由此可见沙苑子总黄酮对DPPH 的清除能力强于抗氧化剂BHT, 说明沙苑子总黄酮具有较强抗氧化活性。

图7 沙苑子总黄酮和BHT 对DPPH 的清除作用结果Fig.7 Results of DPPH clearance by total flavonoids and BHT in Astragalus complanatus

3 结 论

本文使用微波-超声波相结合的提取方法, 乙醇为提取溶液, 有效地提高了沙苑子总黄酮的提得量(与已报到的文献对比[8-10])。 通过Design-Expert 10.0 软件进行二次回归模型设计分析, 得到沙苑子总黄酮的最佳提取工艺参数为乙醇浓度50.87%, 微波时间129.24 s, 超声时间47.01 min, 得率预测值为1.9456%; 根据实际试验操作, 提取工艺参数微调为乙醇浓度50%, 微波时间130 s, 超声时间47 min, 进行3 组平行试验, 得到沙苑子的总黄酮得率1.8138%(RSD=0.39%), 即总黄酮提得量为17.78 mg/g, 与模型预测值相近, 证明该模型可靠有效。 并进行了抗氧化活性研究, 试验结果显示: DPPH 自由基的清除率达到89%, IC50为14.68 μg/mL, 沙苑子总黄酮的抗氧化活性较好。 为进一步研究沙苑子总黄酮的提取工艺、天然药物的抗氧化能力提供可行性的技术参考。