当归六黄汤UPLC指纹图谱的建立及4种成分的含量测定

曾杉，史紫娟，陈伟彦，高永坚，梁凤友

（国药集团广东环球制药有限公司，广东佛山528305）

当归六黄汤源自金代李东垣编纂的《兰室秘藏》，被后世广泛认作“治盗汗”的良药，由当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏、黄芪七味药组成[1‑3]。众医家根据中医理论对当归六黄汤进行组方配伍解析：当归味甘、辛，性温，具有养血作用，生地味甘苦凉，熟地味甘微温，具有滋阴作用，三药合用，共奏滋阴制火之功，共为君药；黄芩、黄连和黄柏味苦性寒，分别具泻上、中、下焦火的作用，三药合用，清热泻火作用更强，共为臣药；黄芪为佐药，味甘性温，可发挥益气固表的作用。全方七味药合用，主治阴虚火旺所致的盗汗[4‑6]。

当归六黄汤作为《古代经典名方目录（第一批）》中收录的方剂之一，临床应用经验丰富。然而该方药味数量多、化学成分种类复杂且含量差异较大，目前针对当归六黄汤物质基础和指纹图谱研究的文献甚少[7‑8]。指纹图谱结合多指标成分含量测定是中药复方制剂一种常用的质控手段，两者结合能够反映经典名方的整体基础物质情况。本研究利用构建的当归六黄汤UPLC 指纹图谱方法，同时测定了处方中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸4 种成分的质量分数，以期为经典名方当归六黄汤物质基准及制剂的开发生产提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H‑class 型高效液相色谱仪（Waters UPLC）；MS105 型电子天平（梅特勒‑托利多公司；2002E 型电子天平（梅特勒‑托利多公司）；KQ‑500DE 型数控超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；MILLI‑PORE Synergy 超纯水仪（美国默克公司）；HN101‑3A型电热鼓风干燥烘箱（南通沪南科学仪器有限公司）；Synergy UV型超纯水仪（美国默克公司）。

1.2 试药

黄芩苷（批号：110715‑201720）、盐酸小檗碱（批号：10713‑201813）、盐酸黄柏碱（批号：111895‑201504）、阿魏酸（批号：110773‑201614）、汉黄芩苷（批号：1112002‑201702）对照品由中国食品药品检定研究院提供；木兰花碱（批号：180226‑004）、千层纸素A 苷（批号：18040202）、表小檗碱（批号：19012103）对照品由中山市成诺生物科技有限公司提供；甲醇、乙腈为HPLC级。

1.3 样品

当归、地黄、熟地黄、黄芩、黄柏、黄连、黄芪均购自主产区或道地产区，由广东一方制药有限公司鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、玄参科植物地黄Rehmannia glutino‑sa Libosch.的新鲜或干燥块根、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根、芸香科植物黄皮Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮、毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎、豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus Hsiao的干燥根。

当归六黄汤共15 个批次，编号为S1-S15，方中7味药的产地信息见表1。

表1 15批样品产地信息Table 1 Origin information of 15 batches of samples

2 方法与结果

2.1 当归六黄汤样品的制备

当归六黄汤在《兰室秘藏》原文中制法记载为“当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏各等分，黄芪加一倍，共为粗末，每服五钱，水二盏煎至一盏。”查阅文献资料，确定金元时期一钱为现今3.73 g，一盏为现今150 mL。依照古方，即称取当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏饮片各2.33 g，黄芪饮片4.66 g，置于1 L电陶瓷煎药壶中，加水300 mL，煎煮至150 mL，煎液分装后进行低温冷冻干燥，得复方冻干粉。

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件色谱柱：Waters CORTECST3（150mm×2.1 mm，1.6 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）‑乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，5%→20%B；15～30 min，20%→25%B；30～45 min，25%→95%B）；柱温为25 ℃；流速为0.25 mL/min；进样量为1 µL；检测波长为285 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备取黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸、木兰花碱、千层纸素A 苷、表小檗碱、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，分别加70%（体积分数，下同）甲醇制成每1 mL 各含黄芩苷189.5 μg、盐酸小檗碱186.2 μg、盐酸黄柏碱49.7 μg、阿魏酸25.1 μg、木兰花碱87.5 μg、千层纸素A 苷86.3 μg、表小檗碱85.4 μg、汉黄芩苷83.2 μg 的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备取当归六黄汤冻干粉约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 精密度试验取同一份当归六黄汤供试品溶液（S5），按“2.2.1”项色谱条件进样6次，导出色谱图并计算相似度均大于0.95，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验取同一份当归六黄汤供试品溶液（S5），按“2.2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，导出色谱图并计算相似度均大于0.95，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验取同一批当归六黄汤样品（S5），平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样测定，导出6 份色谱图并计算相似度均大于0.95，表明方法重复性良好。

2.2.7 指纹图谱的建立及共有峰的标定制备15批当归六黄汤供试品溶液，按指纹图谱方法进行检测，将色谱结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”进行分析，标定20 个特征峰并生成对照指纹图谱，见图1-2。与对照品进行对照，确证了8 个色谱峰，分别为3 号峰盐酸黄柏碱，5 号峰绿原酸，6号峰木兰花碱，8号峰阿魏酸，11号峰表小檗碱，12号峰黄芩苷，14号峰盐酸小檗碱，17号峰千层纸素A苷，18号峰汉黄芩苷。对15批次当归六黄汤指纹图谱与对照图谱之间进行相似度比较，见表2。可见，15 批当归六黄汤样品相似度结果均大于0.90，表明不同产地各药味成分稳定，无较大差异。

图1 15批当归六黄汤UPLC指纹图谱叠加图Figure 1 UPLC fingerprints of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

图2 当归六黄汤UPLC对照指纹图谱Figure 2 HPLC reference fingerprint of Danggui Liuhuang decoction

表2 15批当归六黄汤样品相似度评价结果Table 2 Fingerprint similarities of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

2.3 当归六黄汤中4种成分质量分数的测定

2.3.1 色谱条件同“2.2.1”项色谱条件。

2.3.2 对照品溶液的制备取黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸对照品适量，精密称定，分别加70%甲醇制成每1 mL 各含黄芩苷189.5 μg、盐酸小檗碱186.2 μg、盐酸黄柏碱49.7 μg、阿魏酸25.1 μg的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备取当归六黄汤冻干粉碾细，精密称定0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.4 专属性试验取当归六黄汤供试品溶液（S5）、对照品溶液、空白溶剂按“2.2.1”项下方法进样测定，结果表明黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸4个成分的色谱峰专属性好，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于10 000，见图3。

2.3.5 线性关系考察分别各取“2.3.2”项中4 个成分对照品溶液适量，逐级稀释成质量浓度分别为100%、75%、50%、25%、10%、1%的对照品溶液，按指纹图谱色谱条件测定，记录峰面积‑质量浓度的线性回归方程为：黄芩苷，Y=19 063X+6 744.9（R=0.999 9）；盐酸黄柏碱，Y=5 622.8X-97.04（R=0.999 9）；盐酸小檗碱，Y=20 807X-7 813.3（R=0.999 9）；阿魏酸，Y=12 473X-673.4（R=0.999 9），结果表明黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸分别在1.895～189.5、1.862～186.2、0.497～49.7、0.251～25.1 μg/mL 的范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度试验取同一份当归六黄汤供试品溶液（S5），按“2.2.1”项色谱条件进样6 次，计算黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸峰面积的RSD值分别为1.1%、1.2%、1.1%和1.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验取同一份当归六黄汤供试品溶液（S5），按“2.2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，计算各成分黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸峰面积的RSD 值分别为1.1%、1.3%、1.0%和1.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验取同一批当归六黄汤样品（S5），平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样测定，计算各成分黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸质量分数的RSD 值分别为1.3%、1.1%、1.2%和1.1%，表明方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验取当归六黄汤样品（S1）约0.05 g，按“2.3.3”项方法制备供试品溶液6 份，每组分别精密加入含189.5 μg/mL 黄芩苷对照品溶液4 mL、186.2 μg/mL 盐酸小檗碱对照品溶液4 mL、49.7 μg/mL盐酸黄柏碱对照品溶液1 mL、25.1 μg/mL阿魏酸对照品溶液1 mL。按“2.2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，计算黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸的平均加样回收率分别为98.33%、101.40%、99.19%、97.11%，RSD 分别为1.7%、1.9%、1.5%、1.3%，均满足2020年版《中国药典》要求。

2.3.10 15 批样品的质量分数测定取15 批当归六黄汤冻干粉，按指纹图谱方法同时进行含量测定，计算样品中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸的质量分数，结果见表3。15 批样品中黄芩苷的质量分数范围为10.99～18.82 mg/g、盐酸小檗碱的为11.17～21.46 mg/g、盐酸黄柏碱的为0.41～1.13 mg/g、阿魏酸的为0.28～0.58 mg/g。

2.4 出膏率的测定

取15批当归六黄汤冻干粉，按《中国药典》水分测定法第二法（烘干法）测定水分，按公式“出膏率= 冻干粉质量×（1-水分）/饮片投料量×100%”计算出膏率，结果见表3。15 批当归六黄汤样品的出膏率范围为24.05%～33.89%。

3 讨论

3.1 质量分数测定指标的选择

当归六黄汤经典名方的制备采用水为溶剂进行煎煮，因此选择各药味中具有特征性的水溶性成分作为质量分数测定指标。据文献报道，当归中的阿魏酸具有增强心肌的血液供应、缓解心肌缺血的作用[9]；黄芩中的黄芩苷具有抗氧化、清除自由基、抗病毒和调节免疫系统等作用[10]；黄连中的盐酸小檗碱具有抗菌、抗病毒等作用[11]；黄柏中的盐酸黄柏碱在降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫反应等方面均具有显著效果[12]。以上这些代表成分均是水溶性成分，因此，本研究选择它们作为质量分数测定指标。

3.2 指纹图谱和质量分数测定方法的考察

采用PDA 模式下通过对比不同波长的色谱图，发现在检测波长285 nm 下，当归六黄汤冻干粉供试品溶液检测所得色谱峰信息更丰富，其中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸4个成分峰响应较高，分离度较好，故最终确定以285 nm 作为指纹图谱和质量分数方法的检测波长。在质量分数测定方法考察中，供试品的制备方法分别考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、30%甲醇、水）、提取方式（功率500 W、频率40 kHz 超声30 min 和210 r/min振摇30 min）、提取时间（10、20、30 min）对当归六黄汤中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸质量分数的影响，并进行了方法学考察，最终确定了合适的供试品制备方法。

图3 专属性试验色谱图Figure 3 Chromatograms of specificity

表3 15批当归六黄汤冻干粉的出膏率和质量分数测定结果Table 3 Results of yield and content of 15 batches of Danggui Liuhuang Decoction freeze‑dried powder

3.3 当归六黄汤物质基准研究

本研究制备的15 批当归六黄汤样品的出膏率范围为24.05%～33.89%，平均出膏率为（28.61±8.58）%，15 批样品的出膏率都在均值的±30%范围内，表明3 个产地的不同批次药材质量均一稳定。采用超高效液相色谱法建立了15 批样品的UPLC指纹图谱，并按照2020年版《中国药典》分析方法验证指导要求完成了系统的方法学考察，通过15批样品确定了20 个共有峰。20 个共有峰归属于除佐药黄芪外的六味药材：峰1 为当归、生地黄、熟地黄的共有峰，峰2 归属于熟地黄，峰3 为黄芩和黄柏的共有峰，峰4 为黄芩、黄连、黄柏的共有峰，峰5 归属于黄柏，峰6 为黄连和黄柏的共有峰，峰7、8 为黄芩、黄连、黄柏的共有峰，峰9 归属于黄连、黄柏，峰10、11、12 归属于黄连，峰13 归属于黄芩，峰14、15 归属于黄连，峰16、17、18、19、20均归属于黄芩。通过测定15批样品的黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、阿魏酸4 个成分的质量分数，结果发现河北与山东产地黄芩的黄芩苷质量分数较高，山西产地的较低；重庆与四川产地的黄连中盐酸小檗碱质量分数较高，山西产地的较低；表明不同产地的药材质量分数之间有一定的差异。

指纹图谱结合多指标成分含量测定是对经典名方复方制剂进行整体质量评价的一种重要手段[13]，本研究建立了经典名方当归六黄汤多指标成分含量测定与指纹图谱方法，该方法可用于当归六黄汤物质基准的质量控制。黄芪为本方中的佐药，但黄芪皂苷类成分紫外光谱为末端吸收，受其他药味干扰较大，故本研究未能建立黄芪指纹图谱及含量测定方法。