新型鸭嘴花碱衍生物的合成及其抗炎活性评价

孔令麒, 李美玲, 邹秋萍, 孙 赟, 毛泽伟, 黄 丰

(云南中医药大学 中药学院,云南 昆明 650500)

鸭嘴花碱(Vasicine)是从傣药鸭嘴花(Adhatodavasica)中分离出的一种吡咯并[2,1-b]喹唑啉类生物碱[1]。鸭嘴花碱活性位点较多,与受体结合后表现出广泛的生物活性,如抗炎、平喘、抗氧化和镇咳等[2-3]。鉴于鸭嘴花碱低毒性的特点,其在新药研发方面表现出良好的应用前景[4-6]。鸭嘴花碱分子中含有喹唑啉单元,根据活性片段拼合原理,将活性含氮杂环引入到分子中后,可能得到具有更优药理活性的衍生物。迄今为止,对鸭嘴花碱的研究主要集中在小分子催化领域[7-10],结构修饰方面的报道较少[11-12]。

本文以活性天然产物鸭嘴花碱出发,经取代和Huisgen反应合成了7个新型三唑取代的鸭嘴花碱衍生物(2a～2g, Scheme 1),其结构经1H NMR和13C NMR表征。以地塞米松作阳性对照,采用细菌脂多糖诱导小鼠巨噬细胞Raw 264.7炎症模型对其体外毒性和抗炎活性进行了初步筛选。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AM 400 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标)；Epoch型连续波长酶标仪。

所有试剂均为市售化学纯(上海泰坦科技,上海韶远)；溶剂均为分析纯(天津致远),DMF使用前经干燥处理。

1.2 合成

(1) 化合物1的合成

称取鸭嘴花碱(1.88 g, 10 mmol)加入100 mL二口瓶中,加入30 mL无水DMF,冰水浴冷却,氮气氛围,搅拌下分批加入氢化钠(60%, 0.8 g, 20 mmol),加毕,反应1 h。加入丙炔溴(2.38 g, 20 mmol),于室温反应24 h(TLC检测)。缓慢滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应,加入60 mL冷水,用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,真空浓缩,残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：2%CH3OH-DCM)纯化得淡黄色固体11.51 g,收率67%;1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.93(d,J=6.5 Hz, 1H), 7.48～7.43(m, 1H), 7.44～7.32(m, 1H), 7.21～7.10(m, 1H), 4.75～4.65(m, 1H), 4.41～4.31(m, 1H), 4.29(s, 2H), 3.99～3.68(m, 2H), 2.67～2.49(m, 1H), 2.46(t,J=2.4 Hz, 1H), 2.34～2.17(m, 1H), 2.10～1.90(m, 1H);13C NMRδ: 160.19, 156.74, 148.65, 133.81, 127.41, 126.58, 125.95, 125.67, 120.91, 79.84, 79.17, 75.49, 56.93, 48.22, 46.76, 43.67, 31.1, 27.63; HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C14H14N2O{[M+H]+}227.1179, found 227.1176。

(2) 衍生物2a～2g的合成

依次称取化合物1(90 mg, 0.4 mmol)、五水硫酸铜(25 mg, 0.1 mmol)、叠氮化钠(33 mg, 0.5 mmol)和抗坏血酸钠(99 mg, 0.5 mmol)于25 mL圆底烧瓶中,加入乙醇水溶液(1:1, 5 mL)和0.5 mmol 卤代物,65 ℃反应12 h。 TLC检测反应结束后,二氯甲烷萃取(3×10 mL),有机相用水(3×10 mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥,真空浓缩,残余物以4%CH3OH-DCM为洗脱剂进行柱层析分离得到目标产物。

化合物2a: 收率74%;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.73～7.75(m, 2H), 7.63(s, 1H), 7.47～7.51(m, 1H), 7.34～7.38(m, 3H), 7.27～7.29(m, 2H), 5.57(s, 1H), 5.53(s, 2H), 5.32(s, 1H), 5.08(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.95(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91～4.95(m, 1H), 4.18～4.24(m, 1H), 4.09～4.15(m, 1H), 2.47～2.56(m, 1H), 2.25～2.33(m, 1H);13C NMRδ:160.8, 157.1, 149.0, 144.7, 134.5, 134.2, 129.2, 128.9, 128.2, 127.8, 127.0, 126.4, 123.0, 121.3, 78.8, 63.3, 54.3, 44.0, 28.1。

化合物2b: 收率65%;1H NMRδ: 8.22～8.25(m, 1H), 7.67～7.68(m, 2H), 7.49(s, 1H), 7.41～7.45(m, 1H), 6.33～6.35(m, 3H), 5.36(s, 2H), 5.20(s, 2H), 5.02(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.83～4.86(dd,J=4.5 Hz, 4.2 Hz, 1H), 4.12～4.19(m, 1H), 4.03～4.09(m, 1H), 3.68(s, 6H), 2.39～2.48(m, 1H), 2.20～2.27(m, 1H);13C NMRδ: 161.5, 157.1, 149.1, 144.9, 136.7, 134.3, 127.9, 127.1, 126.6, 123.1, 106.4, 100.6, 78.9, 63.4, 55.6, 55.5, 44.1, 28.3； HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C23H25N5O3{[M+H]+}420.2030, found 420.1656。

化合物2c: 收率63%;1H NMRδ: 8.28(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.71～7.73(m, 2H), 7.59(s, 1H), 7.45～7.49(m, 1H), 7.06～7.17(m, 2H), 6.09～7.02(m, 1H), 5.46(s, 2H), 5.25(s, 2H), 5.09(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.96(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.90～4.93(dd,J=4.5 Hz, 4.4 Hz, 1H), 4.17～4.24(m, 1H), 4.08～4.15(m, 1H), 2.47～2.56(m, 1H), 2.26～2.33(m, 1H);13C NMRδ: 160.8, 157.0, 151.9, 149.4, 149.3, 149.0, 145.2, 134.2, 131.5, 127.7, 127.0, 126.5, 124.4, 124.3, 123.0, 118.2, 118.0, 117.4, 117.3, 78.9, 63.3, 53.1, 44.0, 28.1； HRMS(ESI-TOF)m/z: calcd for C21H19F2N5O{[M+H]+}396.1630, found 396.1620。

化合物2d: 收率70%;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.69～7.75(m, 2H), 7.55(s, 1H), 7.45～7.49(m, 1H), 7.32(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.20(d,J=8.6 Hz, 2H), 5.47(s, 2H), 5.27(s, 2H), 5.29(s, 1H), 5.08(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.95(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89～4.91(dd,J=4.5 Hz, 4.1 Hz, 1H), 4.19～4.24(m, 1H), 4.08～4.14(m, 1H), 2.46～2.54(m, 1H), 2.25～2.32(m, 1H);13C NMRδ: 160.7, 157.0, 148.9, 134.8, 134.1, 133.0, 129.3, 127.7, 126.9, 126.3, 122.9, 78.8, 63.2, 53.4, 43.9, 28.0； HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C21H20ClN5O{[M+H]+}394.1429, found 394.1417。

化合物2e: 收率58%;1H NMRδ: 8.25(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.66～7.72(m, 2H), 7.47(s, 1H), 7.40～7.44(m, 3H), 7.09(d,J=8.4 Hz, 2H), 5.40(s, 2H), 5.24(s, 2H), 5.02(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.83～4.86(m, 1H), 4.12～4.17(m, 1H), 4.04～4.10(m, 1H), 2.40～2.49(m, 1H), 2.20～2.28(m, 1H);13C NMRδ: 160.8, 156.9, 148.9, 145.0, 134.2, 133.4, 132.3, 129.8, 127.7, 127.0, 126.4, 123.0, 122.8, 121.3, 78.8, 63.2, 53.5, 44.0, 28.1。

化合物2f: 收率62%;1H NMRδ: 8.25(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.65～7.69(m, 2H), 7.60(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.52(s, 1H), 7.41～7.45(m, 1H), 7.29(d,J=8.0 Hz, 2H), 5.52(s, 2H), 5.23(s, 2H), 5.05(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.84～4.87(dd,J=4.0 Hz, 4.0 Hz, 1H), 4.13～4.20(m, 1H), 4.05～4.11(m, 1H), 2.41～2.50(m, 1H), 2.22-2.29(m, 1H);13C NMRδ: 160.9, 157.0, 149.1, 145.4, 139.7, 134.4, 133.1, 128.6, 127.8, 127.2, 126.6, 123.2, 113.1, 79.1, 63.3, 53.6, 44.1, 29.8, 28.2。

化合物2g: 收率60%;1H NMRδ: 8.29～8.31(m, 1H), 8.23(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.72～7.75(m, 2H), 7.61(s, 1H), 7.47～7.51(m, 1H), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H), 5.63(s, 2H), 5.30(s, 2H), 5.12(d,J=12.3 Hz, 1H), 4.98(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91～4.93(dd,J=4.0 Hz, 4.0 Hz, 1H), 4.21～4.26(m, 1H), 4.12～4.18(m, 1H), 2.48～2.57(m, 1H), 2.28-2.36(m, 1H);13C NMRδ: 160.9, 157.0, 149.1, 145.5, 141.6, 134.4, 128.8, 127.8, 127.2, 126.6, 124.5, 123.2, 79.1, 63.3, 44.2, 28.2。

1.3 细胞增值抑制实验

将冻存的RAW 264.7细胞迅速解冻后吸入含10 mL DMEM培养基(含10%FBS, 1%双抗)的培养皿中,放置于37 ℃、 5%CO2培养箱中培养。细胞传代后,每个培养皿中加入5 mL左右PBS,按照细胞密度(1×105)稀释。每孔加入100 μL细胞悬液后振荡均匀,置于37 ℃、 5%CO2培养箱中培养24 h。吸出96孔板中的细胞悬液,每孔加入100 μL已配制好的不同浓度的样品溶液(40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25 μmol/L)。继续放入培养箱中培养24 h。取出96孔板,避光加入MTT(每孔10 μL),继续放入培养箱培养4 h,弃上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液。振荡均匀,于490 nm处测定OD值,计算细胞存活率。

1.4 抗炎活性测试

以地塞米松(Dexamethasone)为阳性对照,采用细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7炎症模型评价化合物抑制NO产生的活性。取对数期生长的RAW 264.7细胞(2×106个/mL,100 μL/孔)接种于96孔培养板中,设空白对照组,LPS模型组(加入终浓度为1.5 μg/mL的LPS),待测化合物组(同时加入药物和终浓度为1.5 μg/mL的LPS),地塞米松组(终浓度为10 μmol/L地塞米松和终浓度为1.5 μg/mL LPS),于37 ℃, 5%CO2培养24 h,收集上清液,采用Griess法检测NO含量,每次试验重复3次,计算IC50。

2 结果与讨论

2.1 合成

据文献报道,1,3-偶极环加成反应(Huisgen反应)的条件有很多[13-15],主要采用铜盐催化,并加入抗坏血酸钠,在混合溶剂中反应。在合成目标衍生物时,对反应条件(包括铜盐和溶剂)进行了筛选,结果见表1(以2a为例)。从表1中可以看出,催化剂和溶剂对反应的影响较大。五水硫酸铜的催化效果最好,碘化亚铜次之,醋酸铜的催化效果最差。在筛选的3种溶剂体系中,DMF的反应收率高于四氢呋喃和乙醇。原因可能跟化合物1在混合溶剂中的溶解性有关。优化后,化合物2a的收率可达74%。

表1 Huisgen反应条件筛选

2.2 抗炎活性

以地塞米松(Dexamethasone)为阳性对照,采用细菌脂多糖诱导小鼠巨噬细胞Raw 264.7模型初步测试了目标产物的体外毒性和抗炎活性,结果见表2。从表2可以看出,合成的7个衍生物对巨噬细胞的毒性均较小(EC50>40 μM),化合物2b能够较好抑制NO的生成(IC50=27.13 μM),且效果优于鸭嘴花碱。分析衍生物的结构可知,当苄基苯环上带有供电子基团时抗炎活性较好(2b)；当苄基上含有卤素(2c～2e)或吸电子基团(2f,2g)时活性降低。

表2 化合物的体外抗炎活性

对鸭嘴花碱进行结构改造,合成了7个新型三唑取代衍生物。抗炎活性结果显示,三唑环上电子云密度越高,衍生物的抗炎活性可能越好。这为该化合物进一步的构效关系研究提供了参考。