近红外光谱技术分析高羊茅干草营养成分含量

代露茗，郭 涛，李 飞，王芳彬，贾倩民，潘发明，张爱文，李发弟,5

（1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 / 兰州大学草地农业科技学院 / 甘肃 兰州730020；2. 甘肃省畜牧技术推广总站, 甘肃 兰州 730030；3. 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所, 甘肃 兰州 730070；4. 甘肃省绵羊繁育技术推广站, 甘肃 张掖 734000；5. 甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室, 甘肃 民勤 733300）

畜牧业迅速发展对牧草的需求日益增大[1-2]。高羊茅(Festuca arundinacea)又称苇状羊茅，作为主要的冷季型多年生草本植物，一般在寒冷潮湿的气候中生长，具有生长旺盛、抗旱、抗病虫、适应性强、耐牧性强以及生长季利用时间长等优势[3]。在我国，高羊茅主要分布在华北、西北中南部等无极端寒冷冬季以及华东、华中和西南等海拔较高、温度较低的地区[4]。牧草型的高羊茅具有直立生长、植株高大、叶片粗糙、叶量丰富、生长快和绿期长等特点[5]，可以作为优质的多年生牧草进行长期放牧，或与一些其他的禾本科牧草或者豆科牧草进行混播[6]。作为反刍动物牧草来源之一，基于其良好的草质和丰富的营养，高羊茅既可青饲又可晒制干草。因此评定高羊茅的营养价值，对于反刍动物营养具有生产实践的意义。在目前生产实践中，传统的常规营养成分测定牧草中的营养成分消耗大量的人力、物力和财力[7]，所以需开发牧草营养成分的快速检测技术。

自20世纪90年代以来，近红外光谱分析技术(near-infrared reflectance spectroscopy, NIRS)得到了快速发展。由于NIRS具有方便、快速、高效、无损、低成本和重现性好等优点[8-9]，目前被已应用在产品分析、化工、临床、制药、环境、纺织和食品等众多领域中[10-15]。测定未知样品中的成分浓度和性质时，可以直接利用样品的吸收光谱图和已经建立的矫正模型来进行预测。迄今为止，国内外学者利用NIRS技术建立了苜蓿(Medicago sativa)干草[16-17]、玉米(Zea mays)青贮[18]、小麦(Triticum aestivum)秸秆、玉米秸秆[19]等常见饲用干草各营养成分预测模型，而对于高羊茅牧草营养成分、应用价值等缺乏深入研究以及数据支撑。

本研究旨在利用NIRS将高羊茅干草各营养成分湿化学分析值与近红外光谱数据结合，来分析高羊茅干草中的干物质(dry matter, DM)、粗蛋白质(crude protein, CP)、有 机 物(organic matter, OM)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)、粗脂肪(ether extract, EE)和粗灰分(Ash)的含量，从而建立高羊茅干草的定标模型，为以后研究分析和快速预测高羊茅干草这7种营养成分含量提供可靠的参考和依据，以进一步提高牧草检测技术和应用范围，从而有利于准确地评定饲料营养价值、合理配制动物日粮、充分发挥动物生产性能等。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

本研究在2019-2020年期间随机选取甘肃省庆阳市环县(36°17′01″ N, 107°31′36″ E)的抽穗期高羊茅，进行刈割取样，共计101份。称量鲜重后带回实验室，于105 ℃杀青15 min后，置于65 ℃干燥48 h至恒重。室温回潮6 h后将样品用微型植物试样粉碎机(FZ 102, 中国)粉碎，过1.00 mm筛。将粉碎过筛后的样品混合均匀，密封于自封袋中，干燥避光，常温保存，以备近红外光谱仪扫描和湿化学分析。

1.2 高羊茅干草常规营养成分含量的测定

高羊茅干草中DM和Ash含量的测定按照GB/T 6438-2007和GB/T 6435-2006的标准使用全自动水分灰分仪(Pre-ASH 340，瑞士)进行测定。CP含量的测定按照GB/T 24318-2009的标准，使用杜马斯定氮仪(DN 2000，中国)进行测定。NDF和ADF含量的测定使用半自动纤维分析仪(ANKOM a200i，美国)进行测定。EE含量的测定按照GB/T 6433-2006的标准使用全自动脂肪仪(ANKOM XT15i，美国)进行测定。最终数据通过Excel 2019进行统计整理。

1.3 高羊茅干草近红外分析

1.3.1 近红外光谱图的采集

本研究利用光谱为850～2 500 nm的多功能近红外分析仪(FOSS 2 500，丹麦)对高羊茅样品扫描来进行近红外光谱图的采集。先将仪器预热30 min左右，然后将样品混合均匀后装入样品杯的1/3～2/3处，每个样品进行3次重复装样后扫描，最后取3次光谱的平均值作为该样品的光谱图，并对平均光谱图进行一阶导数处理和二阶导数处理，光谱图中的特征谱峰会有所增加[19]。

1.3.2 近红外预测模型的建立与验证

本研究使用WinISI IV软件对高羊茅的近红外吸收光谱图和湿化学实测值统计分析处理。在建立定标模型之前，将各营养成分按含量高低进行排序，按1∶4的比例将样品分为验证集(n= 20)和定标集(n= 81)。使用MPLS对各种不同营养成分分别构建定标模型。

鉴于光谱会受到光谱漂移、背景信息和噪声等因素影响而产生干扰，需要结合不同的导数处理对光谱进行散射校正，其中光谱的散射校正处理方式包含11种：无处理(none)；标准正态变量变换结合散射处理(SNV and Detrend)；标准正态变量变化(SNV only)；去散射处理(Detrend only)；标准多元离散矫正处理(Standard MSC)；加权多元离散矫正处理(Weighted MSC)；反向多元离散矫正处理(Inverse MSC)；导数范围和补偿处理(Scale and Offset)；导数范围和线性处理(Scale and Linear)；导数范围和二次处理(Scale and Quadratic)；导数、导数范围和补偿处理(Derivative, Scale and Offset)。导数处理方式包含3种：0, 0, 1, 1、1, 4, 4, 1、2, 4, 4, 1，逗号间隔的4个数字依次表示：导数处理阶数、导数数据间隔、一次平滑点数和二次平滑点数。在创建预测模型的过程中，进行内部交叉验证和外部验证，使用全局距离(global hood, GH ≥ 3)和“T”检验(T ＞ 2.5)来对异常的样品数据进行剔除[20]。

1.3.3 高羊茅干草近红外预测模型的评价

采用交叉验证相关系数(coefficient of determination for cross-validation, 1-VR)、定标标准分析误差(standard error of calibration, SEC)、交 互 验 证 标 准 分 析 误 差(standard error of cross-validation, SECV)指标来判断定标模型的准确性。其中1-VR值越大，则预测模型效果越好；SEC值和SECV值越小，则预测模型效果越好[16]。当1-VR值最大，SECV值最小时预测模型准确性相对较高，可作为高羊茅干草最佳定标模型[21]。

在对验证集数据进行评价时，参考预测决定系数(coefficient of determination for validation, RSQ)，其中RSQ值越接近于1，则预测模型效果越好。如果在0 ＜ RSQ ≤ 0.25时，表示创建的预测模型不可用；在0.26 ≤ RSQ ≤ 0.49时，表示创建的预测模型的相关性较差；在0.50 ≤ RSQ ≤ 0.64时，表示创建的预测模型可以用来粗略地筛选样品；在0.66 ≤ RSQ ≤0.81时，表示创建的预测模型可以用在实际生产中的预测；在0.83 ≤ RSQ ≤ 0.90时，表示创建的预测模型可以用在一些生产实践中的精确预测[16,22]。

利用外部验证相对分析误差(ratio of performance to deviation for validation, RPD = SD/SEP)验证预测模型的准确性时，在RPD ＜ 2.0时，表示创建的预测模型预测效果较差，不能用于实际生产实践之中；在2.0 ≤ RPD ＜ 2.5时，表示创建的预测模型预测能力相对较弱，不能代表湿化学分析实测值，但可以用于粗略地预测含量；在RPD ≥ 2.5时，表示创建的预测模型可以用于实际的分析当中[8,23]。

2 结果

2.1 高羊茅干草常规营养成分含量

高羊茅干草7种营养成分的含量变化范围较大，有足够的变化梯度，符合利用近红外光谱技术来建立牧草营养成分预测模型的要求(表1)。DM变异程度最小，Ash变异程度最大。定标集和验证集各营养成分湿化学分析结果(表2)显示，其中在定标集中，DM含量在93.71%～96.72%，CP含量在11.28%～29.71%，OM含量在77.43%～98.93%，NDF含量在30.27%～58.32%，ADF含量在14.12%～34.01%，EE含量在1.76%～5.79%，Ash含量在1.07%～22.57%。验证集中各营养成分的含量都在定标集的范围内，其中DM含量在94.29%～96.30%，CP含量在11.40%～25.06%，OM含量在79.37%～94.78%，NDF含量在31.07%～52.74%，ADF含量在15.90%～29.03%，EE含量在1.82%～4.89%，Ash含量在3.06%～18.49%。

表1 高羊茅干草7种营养成分湿化学分析结果(干物质基础)Table 1 Results of wet chemical analysis of seven nutrients in tall fescue hay (DM basis)

表2 高羊茅干草定标集和验证集各营养成分含量(干物质基础)Table 2 Nutrient content in the calibration set and validation set of tall fescue hay (DM basis)

2.2 高羊茅干草近红外扫描光谱图

经过对每个样品3次重复装样扫描后求平均得到最终的平均光谱图 (图1)，高羊茅中各营养成分种类和含量的不同以及含氢键的数量不同，使得到的光谱图中存在很多吸收峰。图2和图3分别为高羊茅干草近红外扫描光谱图为了消除基线漂移和背景信息的影响，一阶导数处理和二阶导数处理后得到的光谱图。

图1 高羊茅干草近红外原始光谱图Figure 1 Near-infrared spectrogram of tall fescue hay

图2 高羊茅干草一阶导数处理光谱图Figure 2 First derivative spectrogram of tall fescue hay

图3 高羊茅干草二阶导数处理光谱图Figure 3 Second derivative spectrogram of tall fescue hay

2.3 高羊茅干草近红外定标模型的建立

利用WinISI Ⅳ软件将高羊茅干草7种营养成分的近红外光谱数据与湿化学分析值相结合，再结合11种去散射处理和3种导数处理后，分别对7种营养成分进行单独的定标。以最大1-VR值和最小SECV值为依据，筛选出每种营养成分最佳定标模型的处理方式如表3所列。不同营养成分的最佳光谱处理方式和导数处理方式有所不同，其中DM的光谱和导数处理的最佳组合是none和1, 4, 4, 1；CP的光谱和导数处理的最佳组合是Derivative，Scale and Offset和2, 4, 4, 1；OM的光谱和导数处理的最佳组合是none和2, 4, 4, 1；NDF的光谱和导数处理的最佳 组 合 是Derivative，Scale and Offset和1, 4, 4, 1；ADF的光谱和导数处理的最佳组合是Scale and Quadratic和0, 0, 1, 1； EE的光谱和导数处理的最佳组合是Detrend only和1, 4, 4, 1； Ash的光谱和导数处 理 的 最 佳 组 合 是SNV and Detrend和2, 4, 4, 1。7种营养成分的最佳定标模型中的SEC、SECV和1-VR值 分 别 为：DM为0.17、0.22和0.85，CP为0.33、0.67和0.97，OM为1.22、1.42和0.81，NDF为1.40、1.63和0.86，ADF为0.99、1.09和0.80，EE为0.21、0.28和0.84，Ash为0.99、1.52和0.80。

表3 高羊茅干草各营养成分最佳定标模型Table 3 Optimal calibration models of nutrients in tall fescue hay

2.4 高羊茅干草最佳近红外定标模型的验证

在高羊茅干草最佳近红外定标模型建立后，用20个验证集样品进行验证，如表4所列验证集中DM的RSQ、SEP、RPD值分别为0.85、0.21和2.55，CP的分别为0.94、0.83和3.53，OM为0.78、1.58和2.17，NDF的分别为0.78、2.38和2.04，ADF的分别为0.84、1.21和2.06，EE的分别为0.79、0.28和2.06，Ash的分别为0.77、1.47和2.02。因此，建立的高羊茅干草7种营养成分的近红外预测模型(表4)，其中OM、NDF、ADF、EE、Ash的最佳定标模型中2.0 ≤ RPD ＜ 2.5，表明可以用在实际生产中的一些粗略的预测；DM、CP的最佳定标模型中RPD ≥ 2.5，表明可以用于一些准确度要求较高的预测，其预测精度相对较高。

表4 高羊茅干草最佳定标模型验证结果Table 4 Validation results of the optimal calibration model of tall fescue hay

高羊茅干草每种营养成分的预测值与湿化学分析值的相关性关系如图4所示，其中CP的R2为0.937 4，表明预测值与湿化学分析值的相关性关系最好，DM的R2为0.738 6, 表明预测值与湿化学分析值的相关性关系较差。

图4 营养成分含量的预测值与化学测定值的相关性Figure 4 Correlation between predicted value and chemical measured value of nutrition component

3 讨论

相关学者已经建立了玉米青贮[24]、苜蓿干草[16]、油菜(Brassica campestris)秸秆[20]、小麦秸秆[19]、高粱(Sorghum bicolor)[25]等一些饲用粮草的营养成分预测模型。闫佰鹏等[20]基于NIRS技术，对采集到的125份油菜秸秆样品测定其营养成分，分别建立定标模型，最终内部验证结果高于外部验证结果，可能与饲料样品的性质、实验室测定值的误差以及所选取的外部验证样本数有关，油菜秸秆DM、CP、NDF、 ADF、 EE和Ash的 1-VR 均 在 0.90 左右，所建立的NIRS模型是可行的，中性洗涤不溶蛋白质(neutral detergent insoluble protein, NDIP)、酸 性 洗 涤不溶蛋白质(acid detergent insoluble protein, ADIP)、酸性洗涤木质素(acid detergent lignin, ADL)所构建NIRS 模型效果不太理想，还需进一步优化；何云等[16]

利用265份苜蓿干草样品分析验证后所建立DM、CP、NDF、ADF和Ash的各营养成分定标模型，其中DM、CP、NDF和ADF的RSQ值都大于0.80，外部验证的RPD值都大于2.50，均可用于实际生产中的预测，但是Ash的RSQ值和RPD值都较低，只能用于粗略的预测，这可能是由于物质本身的化学结构与测定方法的准确度与精确度的影响，因为NIRS是根据有机物中的含氢基团对近红外光的吸收，物质结构越简单越容易形成明显的吸收光谱，而且NIRS 这种间接分析技术的结果与常规测定的准确性和精密度相关；常春等[26]利用120份羊草(Leymus chinensis)样品，全面建立了DM、CP、NDF、ADF、ADL、EE等9项羊草品质NIRS模型，除EE外，各项指标均可用于实际生产中的测定，可能是由于牧草中的EE含量较低，化学测量误差相对较大。

本研究中在两种光谱处理后，光谱图中的特征谱峰都有所增加，证实了在一定程度上消除了一些外界因素的影响。在1 436 nm附近的吸收峰可能是由多种因素形成：与脂肪族和芳香族碳氢化合物相关的亚甲基(-CH2)的C-H结合带、淀粉的C-H伸缩；酰胺、蛋白质或芳香胺的N-H伸缩；酮的C=O伸缩等。1 926 nm附近的吸收峰可能与水分子和多糖中的O-H伸缩和HOH变形结合、酰胺中的C=O伸缩有关。2 100 nm附近的吸收峰可能与淀粉O-H弯曲或C-O拉伸有关，也可能与淀粉或纤维素的C-O拉伸有关。而2 302 nm附近吸收峰可能与蛋白质的C-H弯曲、由淀粉和其他多糖结合而成C-H伸缩和CH2变形、连接到肽链的N-H上的C=O氢键、以及多糖的C-H弯曲有关[27]。2 488 nm处的吸收峰与纤维素的C-H拉伸和C-C结合有关[24]。

本研究共采集101份高羊茅样品，使用NIRS技术结合湿化学分析值建立了高羊茅干草DM、CP、OM、NDF、ADF、EE和Ash预测模型。每种营养成分的定标模型和验证结果都有所不同，原因可能是不同营养成分中所含有机官能团的种类与数量都有所不同，导致近红外光在不同波段有不同的吸收。这7种营养成分的预测模型中1-VR全都在0.80以上，相关性分析R2都在0.70以上，再结合RPD值，各项营养成分的RPD值均大于等于2。这表明所建立的高羊茅干草DM、CP、OM、NDF、ADF、EE和Ash预测模型均可用于实际生产中的预测[22]。其中CP的定标模型中1-VR和RPD值最高，分别为0.97和3.53，表明预测效果最好，这可能是由于含氮化合物蛋白质中主要含氢基团为N-H键，在近红外光谱区会产生很强的吸收峰，因而可以获得较好的定标结果。EE、ADF和NDF的定标模型中1-VR和RPD值较CP、DM和OM低的原因可能是在高羊茅牧草中脂肪含量较低，湿化学分析误差较大；ADF和NDF中纤维素和木质素等的内部结构较复杂。Ash的定标模型中1-VR和RPD值最低，可能是因为粗灰分是无机物，没有含氢键，在近红外光谱区没有吸收，而是通过影响其他含氢键的吸收来间接测定粗灰分的含量，导致预测结果较不稳定。

4 结论

本研究利用101个高羊茅样品，结合NIRS以及MPLS来建立了高羊茅干草DM、CP、OM、NDF、ADF、EE和Ash这7种营养成分的预测模型。其中建立的DM和CP的预测模型RPD值为2.55和3.53，预测模型的预测效果较好，可以用于实际生产中的预测成分含量；OM、NDF、ADF、EE和Ash的预测模型RPD值为2.17、2.04、2.06、2.06和2.02，所预测的结果可以作为饲料生产中的参考。