杨山牡丹生防内生细菌的分离及鉴定

刘雪停，夏彦飞,2*，李 身，雷荣月，徐建强，林晓民*

（1.河南科技大学，河南 洛阳 471003；2.桂林医学院 附属医院，广西 桂林 541001）

杨山牡丹（Paeonia ostii）是我国传统花卉牡丹（P. suffruticosa）的1个栽培品种，除了具有观赏价值外，因其根具有镇痛、消炎、抗肿瘤等功效，也被广泛应用在医学研究领域［1-2］。随着种植面积的持续扩增及病害的逐年积累，牡丹病害种类越来越多，危害也逐年加重。大量牡丹病害的发生导致了牡丹花色衰退、生长受阻、药用价值下降，严重制约了牡丹产业化的发展［3］。目前，已记录的牡丹病害种类有27种，主要有牡丹灰霉病、牡丹黑斑病、牡丹黄斑病和牡丹线虫病等［4］。化学药剂具有防效好、见效快的特点，施用化学药剂一直是牡丹病害防治的主要手段，但是大量化学药剂的使用给人类健康和环境安全带来了隐患，导致不少药剂被禁用或即将禁用，因此，开发高效、无毒的微生物制剂已成为控制牡丹病害的研究热点，也符合可持续发展和绿色环保的理念［5-6］。

植物内生菌是指能存活于健康植物组织内部的一类微生物，具有独立繁殖和传导特性，其与寄主植物长期协同进化，产生与寄主相同或相似的生物活性物质，因此人们对此类微生物产生了极大的兴趣［7-10］。研究表明，植物内生细菌具有促进植物生长，提高寄主植物的抗病性，增强植物对环境的抗逆性等特性［11-14］。已报道的植物内生细菌主要集中在变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria ） ；常见的植物内生细菌属有假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Micrococcus）、泛菌属（Pantoea）、寡单胞菌属（Stenotrophomonas）、微杆菌属（Microbacterium）［15-16］。 目前，已报道具有生防作用的牡丹内生细菌为芽孢杆菌属的6个种，分别是解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、短小芽孢杆菌（B. pumilu）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、假真菌样芽孢杆菌（B. pseudomycoides）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）［17-19］。总体来看，关于牡丹生防内生细菌的研究偏少，鉴于此，笔者对杨山牡丹内生细菌进行了分离鉴定，并对其抑菌机制进行了初步研究，旨在筛选出能产生抑菌活性物质的生防内生细菌，为牡丹病害的生物防治提供新的微生物菌种资源。

1 材料和方法

1.1 实验材料

采取6、7月份洛阳市各牡丹园区内的杨山牡丹植株的根、茎、叶，收集新鲜样本后立即带回实验室，用自来水清洗干净。

1.2 培养基

本研究所用的PDA培养基、LB固态培养基、LB液体培养基的配制及灭菌方法参照《现代微生物学实验技术》［20］。细菌发酵培养基为Landy培养基，具体配方参考Landy等的研究方法［21］。

1.3 指示植物病原菌

牡丹黑斑病菌（Alternaria suffruticosae）、牡丹黄斑病菌（Phyllosticta commonsii）、牡丹腔孢叶斑病菌（Hainesia lythri）、牡丹灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、北方根结线虫（Meloidogyne arenaria）均为本实验室保存。

1.4 牡丹内生细菌的分离和纯化

取植株根、茎和叶，先用自来水冲洗干净，再用无菌水清洗3~5次，然后按照杨瑞先等的方法进行表面灭菌；取最后1次漂洗植物组织的无菌水涂布平板，检查灭菌效果［17］。向各消毒组织加入10 mL无菌水，研磨；吸取研磨液，采用稀释涂平板法将其涂布于LB固体培养基，在28 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。挑出菌落形态各异的单菌落进一步纯化分离，在4 ℃下保存。

1.5 拮抗菌株的筛选

对挑取的纯培养菌株用Landy培养基进行发酵培养，利用平板对峙法和浸渍法筛选出有拮抗活性的内生细菌。发酵培养条件参考Landy等的方法［21］。收集培养滤液，在4 ℃下以12000 r/min的转速离心20 min；取上清液，过0.22 μm微孔滤器，此过滤液即为内生菌上清液。

在PDA平板中心分别接种直径为5 mm的4种牡丹病原真菌菌饼，将内生菌上清液5 μL用十字交叉法接种在距离菌饼2 cm的灭菌滤纸片上，置于28 ℃恒温培养箱培养。待对照病原菌菌丝长满平板时，测量其抑制效果；实验独立重复3次。采用同样的方法对有抑菌作用的内生菌株进行复筛，并在显微镜下观察生防菌株拮抗部分病原真菌菌落边缘菌丝的生长形态；实验独立重复3次。

内生细菌对北方根结线虫的拮抗活性实验参考Xia等的方法［22］，即先将2 mL内生菌上清液放入直径为6 cm的灭菌表面皿中，然后挑入50条北方根结线虫2龄幼虫，置于25 ℃培养箱，12 h后统计线虫的死亡数；实验重复3次。用无菌水和无菌Landy培养基作为对照；实验独立重复3次。对有杀线虫效果的菌株采用同样的方法进行复筛；实验独立重复3次。

1.6 生防内生细菌的鉴定

对有拮抗活性的牡丹内生菌进行形态和生理生化鉴定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》［23］和《原核生物进化与系统分类学实验教程》［24］。

利用Axygen DNA提取试剂盒提取拮抗菌株的基因组。细菌16S rDNA扩增所用引物为27F（5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）。gyrB基 因扩增简并引物为UP-2r（5＇-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3＇）和UP-1（5＇-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3＇）（Y代表C或者T；M代表A或者C；R代表A或者G；N表示任一碱基）。用Axygen胶回收试剂盒回收目的片段，并将其送南京思普金生物科技有限公司测序。将菌株的16S rDNA和gyrB基因的测序序列与GenBank中已登录的序列进行BLAST比对，确定与该菌株亲缘关系最近的种属，获取相似性较高的相关种的序列。将拮抗菌株和相关属的16S rDNA和gyrB基因序列分别进行拼接，用ClustalX软件进行多序列比对，应用Mega 4.0的Neighbor-Joining（NJ）方法构建系统发育树（稳定性检测重复取样1000次），并进行聚类分析。

1.7 数据分析

实验所得数据采用SPSS 20.0软件（SPSS inc.， Illinois， USA）的单因素方差分析方法（ANOVA）进行显著性检验，用最小显著性差数法（Least Significant Difference， LSD）进行两两比较，以P<0.05作为检验差异显著性的标准。

2 结果与分析

2.1 杨山牡丹内生细菌的分离和筛选

根据细菌菌落形态的不同，本研究共从杨山牡丹的根、茎、叶组织中分离出211株内生细菌，其中从根分离出41株，从茎分离出155株，从叶分离出15株。经初筛，有42个菌株的发酵上清液对4种牡丹病原真菌和北方根结线虫具有拮抗活性。对这42株菌株进行复筛，其中6株内生细菌（YMG34、YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143、YMY13）表现出稳定的拮抗活性，用其上清液处理北方根结线虫12 h，线虫的死亡率均为100%。菌株YMG34对黄斑病菌和黑斑病菌的抑制直径最大，其抑制效果与YMJ78、YMJ143、YMY13的处理存在显著差异；菌株YMG34对灰霉病菌的抑制直径为31.89 mm，与菌株YMJ78和YMY13的处理也存在显著差异；YMJ78菌株对腔胞叶斑病菌的抑制直径最大，为32.22 mm，与菌株YMJ141的处理存在显著差异（表1）。

表1 6株内生细菌菌株对牡丹病原真菌的抑制作用

2.2 拮抗生防内生细菌的鉴定

6株菌株的生理生化特征（表2）与《常见细菌系统鉴定手册》描述的芽孢杆菌属的特征基本一致，初步鉴定这6株生防菌属于芽孢杆菌属（Bacillus spp.）［6］。

6株生防内生细菌的16S rDNA和gyrB基因的核酸测序序列长度见表3。将6株内生菌株的16S rDNA和gyrB序列分别在GenBank数据库进行比对，结果显示都与芽孢杆菌属部分菌株的基因序列相似度最高。把这6株生防内生细菌及选取的同源性较高的芽孢杆菌菌株的16S rDNA和gyrB基因的序列分别拼接后，采用Mega 4.0构建系统发育树，如图1所示，菌株YMG34与巨大芽孢杆菌处于同一分支中；YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143以及YMY13与耐盐芽孢杆菌聚在一个分支上。分别结合6个菌株的生理生化特性，YMG34菌株被鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），菌株YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143和YMY13被鉴定为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）。

2.3 拮抗生防内生细菌对病原菌菌丝生长抑制效果的显微观察

牡丹黄斑病原菌、黑斑病原菌、灰霉病原菌受内生细菌菌株YMG34、YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143、YMY13抑制后，其病原菌菌丝生长明显受阻。在光学显微镜（10×40倍）下观察对峙平板中边缘菌丝的变化情况，与对照菌丝（图2中的CK1、CK2、CK3）比较，受生防细菌抑制的病原菌菌丝缩短变粗，生长变形扭曲，有瘤状突起、缢缩、细胞膨大等畸变（图2中的A、B、C、E、F、G、I、J、K、M、N、O、Q、R、S、U、V、W）。腔胞叶斑病原菌受6株内生细菌作用后，菌落周围区域变为深褐色，除了YMY13菌株的处理能在10×40倍光学显微镜下观察到菌丝的变化状况外，其余拮抗菌的处理只能在10×20倍下观察到结果。腔胞叶斑病原菌的菌丝受YMY13菌株处理后，也变粗缩短，生长变形扭曲，有瘤状突起、缢缩、细胞膨大等畸变现象（图2X），而该菌株受其余5株拮抗菌处理后，只能看到瘤状突起（图2中的D、H、L、P、T）。

表2 6株内生细菌菌株的生理生化特征

表3 6株内生细菌菌株的16S rDNA及gyrB基因的序列长度

图1 基于16S rDNA和gyrB基因序列串联构建的6株内生细菌的系统进化树

图2 6株内生细菌菌株对牡丹病原真菌菌丝的影响

3 结论与讨论

近年来，随着人们对牡丹观赏价值、药用价值以及食用价值认识的不断深入，牡丹种植面积逐渐增多，品种多样化，结果导致植物病害越来越多，危害也逐年加剧。芽孢杆菌属细菌具有抗逆性强的芽孢，可以产生多种抗菌物质，非常有利于微生物农药的开发和推广。因此，利用芽孢杆菌来控制牡丹病害成为新的研究热点。如杨瑞先等先后从牡丹根部分离出6株芽孢杆菌菌株，其对牡丹黑斑病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、黄斑病菌具有明显的抑制作用［17－18］。分离于牡丹根部的枯草芽孢杆菌Md10菌株和短小芽孢杆菌Md20菌株对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。

本研究也从牡丹组织内分离出共同拮抗牡丹黄斑病原菌、黑斑病原菌、灰霉病原菌、腔胞叶斑病原菌及北方根结线虫的6株内生细菌，其中根部1株（YMG34）、茎部4株（YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143）、叶部1株（YMY13）。在本研究中，除了这6株内生菌表现出稳定的广谱抗性外，还有一些菌株对单一病害呈现了较强的拮抗活性（未发表数据）。本研究不仅充实完善了牡丹生防微生物菌种资源库，而且为将来6株生防内生细菌菌株的进一步开发利用提供了理论依据。

16S rDNA基因序列是细菌分类常用的基因标记，但是很难对序列相似度较高的同源性芽孢杆菌种群进行区分，因此学者们开发了一些新靶标如gyrA、gyrB、rpoD等基因来区别芽孢杆菌的近缘种［25-27］。喻国辉等结合16S rDNA、gyrA、gyrB等基因将分离于石斛兰的R13生防菌株鉴定为枯草芽孢杆菌［28］。郭洁心等采用同样的研究方法，把从丁香树茎部分离的1株植物生防内生细菌G-1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌［29］。本研究利用传统形态鉴定、生理生化特征实验、16S rDNA与gyrB基因联合分析方法，成功鉴定出5株耐盐芽孢杆菌（YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143和YMY13），以及1株巨大芽孢杆菌（YMG34菌株）。

植物内生细菌能利用代谢过程中产生的活性物质如伊枯草菌素、表面活性素、泛革素等来抑制植物病原菌的生长或蔓延［30］。据杨瑞先等报道，苏云金芽孢杆菌Md1-14菌株、假真菌样芽孢杆菌Md3-14菌株、贝莱斯芽孢杆菌Md2-17和Md2-35菌株的代谢产物对牡丹灰霉病原菌有显著的抑制作用，导致病原菌菌丝缩短变粗、分支增多成簇状、原生质体凝集等现象［18］。Xu等也发现枯草芽孢杆菌1-L-29菌株拮抗油茶炭疽病菌后，菌丝出现变形、膨大等现象［31］。本研究分离得到的6株内生菌的代谢产物也能抑制4种植物病原菌菌丝的生长，导致菌丝扭曲、变粗缩短、有瘤状突起等畸变现象，表明这6株内生细菌具有防治牡丹病害的潜力。

尽管本研究确定6株生防内生菌对5种植物病原菌具有拮抗活性，但具体是何种物质起作用，其作用方式如何，是否会产生新的活性物质，以及田间对牡丹病害的防治效果如何，均有待进行下一步的试验研究。