基于Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化超声诱导防风种子发芽方法

李占君 刘运伟 王洪学 王岩 房柱 兴成彬

摘 要：為研究一种超声诱导促进防风种子发芽的方法，本文以超声时间、超声功率、水浴温度、超声频率以及浸种时间展开单因素影响实验。在单因素实验的基础上运用PBD（Plackett-Burman Design）进行关键因素的筛选，通过爬坡实验得出关键因素的中心点。结合BBD（Box-Behnken Design）响应面优化关键因素条件，最终得出最佳超声诱导防风种子发芽因素为：超声时间16 min、超声功率62 W、水浴温度 35 ℃、超声频率40 Hz和浸种时间2 d， 且预期发芽率和预期发生概率分别为68.21%和98.70%。该条件下防风种子发芽率为65.66%，其相对误差为3.74%。最佳超声诱导条件实验组与空白组相比，其发芽率、发芽势和发芽指数均优于空白组，且发芽率最终提升了29.71%。超声诱导处理与空白组种皮扫描电镜结果得知，种皮条纹裂隙阻塞程度与通透性会因超声过程中所产生的“空化效应”的作用得到较大程度的改善。研究表明适宜超声诱导处理对防风种子的萌发具有积极促进作用。

关键词：PBD;BBD;超声诱导;防风种子;发芽率;种皮微观结构

中图分类号：S723.1+31.1;S718.3   文献标识码：A  文章编号：1006-8023（2022）01-0076-10

Optimization of Ultrasonic Induced Germination of Saposhnikovia divaricate

Seeds Based on Plackett-Burman and Box-Behnken Design

LI Zhanjun1， LIU Yunwei1， WANG Hongxue1， WANG Yan2， FANG Zhu1， XING Chengbin1

（1.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China;

2.Heilongjiang Academy of Forestry， Harbin 150081， China）

Abstract：In order to study a method of promoting seed germination of Saposhnikovia divaricate seed by ultrasonic induction， in this article， single factor experiments were carried out based on ultrasonic time， ultrasonic power， water bath temperature， ultrasonic frequency and seed soaking time. Based on the single factor experiment， Plackett-Burman Design （PBD） was used to screen the key factors， and the central point of the key factors was obtained through the climbing experiment. Optimize key factors and conditions in combination with Box-Behnken Design （BBD） response surface， the best ultrasonic-induced seed germination factors of the Saposhnikovia divaricata seed were： ultrasonic time 16 min， ultrasonic power 62 W， water bath temperature 35 ℃， ultrasonic frequency 40 Hz， seed soaking time 2 d， and the expected germination rate and expected occurrence probability were 68.21% and 98.70%， respectively. Under this condition， the germination rate of Saposhnikovia divaricate seed was 65.66%， the relative error was 3.74%. Compared with the CK group， the germination rate， germination potential and germination index of the experimental group were better than those of the CK group， and the germination rate was finally increased by 29.71%. The results of ultrasonic induction treatment and scanning electron microscope of CK seed coat showed that the blockage degree and permeability of seed coat stripe cracks could be greatly improved by "cavitation effect" produced in the process of ultrasound. Research showed that ultrasonic treatment had a positive effect on Saposhnikovia divaricate seed germination.

Keywords：PBD; BBD; ultrasonic induction; Saposhnikovia divaricate seed; germination rate; seed coat microstructure

0 引言

中草药防风（Saposhnikovia divaricata （Trucz.） Schischk）为伞形科，防风属，多年生草本植物[1-2]。我国古代人们很早就应用防风治疗一些病症，具有久远的发展史，其自身对外界生存环境具有较强的适应能力，主要分布于我国的北方平原和半山区[3]。防风植株根部含有大量的药用活性成分，现阶段经有效分离鉴定出的有活性成分有100余种，其中代表性活性成分包括：有机酸、色原酮、香豆素、甘露类以及淄醇类化合物等[4- 5]。医药领域主要以未抽花植株的干燥根入药，进行病症的治疗[6]。

相关研究表明，防风中所含有效活性成分具有较好的抗氧化能力，是一种天然性抗氧化剂，在食品、制药领域扮演重要的角色，同时也被作为大宗药材广泛应用于抗肿瘤、镇痛、抑菌以及解热等多种病症，具有重要的作用和意义[7-8]。由于防风药用价值较高，而药用防风主要以野生防风为主，致使防风药用资源被过度的开发与应用，而防风种子主要通过收集野生防风种子的形式获得，致使现阶段我国野生防风资源遭受严重破坏，野生防风资源储备已远不能满足中医药领域的需求[9-10]。国内外相关研究人员，对防风药用资源现状以及人工培育已展开的工作进行了研究和探讨，其人工培育方式有：种子直播、幼苗移栽和根段营养繁殖等[11-12]。防風中有效活性成分会因人工培育方式的不同而有显著性差异，目前种子培育过程中常规方式为直播培育[13]。由于东北防风自身生理原因，种子内部种胚需要经过后熟作用才能进行育种，此过程对防风的人工育种带来了不可避免的限制和影响，因此防风的人工育种方法急需优化、改进。适宜的超声对种子萌发具有积极促进作用，而现阶段国内未见超声诱导防风种子萌发相关性研究报道，种子发芽的研究主要集中在单纯性单因素处理，较为简单、系统性不强，未能对各影响因素进行互扰、线性工艺的优化。应用PBD （Plackett-Burman Design）可对各影响因素分析，筛选出主要关键性影响因素;结合BBD（Box-Behnken Design）对筛选得出的主要关键性因素予以回归方程的拟合、分析，通过优化得到最佳影响参数。

本实验主要研究超声波刺激诱导防风种子的发芽的方法，对影响种子发芽的影响因素进行分析与研究。实验过程中，以超声时间（min）、超声功率（W）、超声水浴温度（℃）、超声频率（Hz）和浸种时间（d）为单因素实验;对单因素实验数据进行了PBD分析;根据Pareto chart和各影响因素的贡献率筛选出3个关键因素：超声时间（min）、超声功率（W）和超声水浴温度（℃） 。对这3个关键因素进行BBD优化，最终得出超声诱导防风种子发芽的因素参数。对最佳超声条件下的防风种子指标系数进行了测定。应用扫描电镜（SEM）对超声诱导处理前、后的防风种皮微观结构进行镜检对比与分析。研究成果能为防风种子及其他植物种子的人工育种提供科学的理论和实验性参考。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

优等东北防风种子，2019年9月采收于内蒙古海拉尔;脱脂棉、培养皿、滤纸、镊子、解剖剪、无水乙醇、超纯水、4%次氯酸钠溶液等。

1.2 仪器

恒温培养箱（MJ-500-11，上海一恒科技有限公司）;台式数控超声波清洗器（KQ-100DE，昆山市超声仪器有限公司），净化工作台（SW-CJ-2FD，苏州广源净化科技有限公司）;超纯水机（CMPL-TP-40L，成都优越科技有限公司）;理化干燥箱（LG100B，上海仪器总厂）;其他仪器玻璃器皿（天津化学玻璃仪器厂）;扫描电镜（EVO 18，德国蔡司）等。

2 实验方法

2.1 种子的处理实验

预处理实验：取适量防风种子，40 ℃温水分别浸种0、1、2、3 d。

空白对照实验（CK）：以40 ℃温水浸泡1 d的种子为研究对象，75 %乙醇溶液浸泡20 s，同时灭菌纯水冲洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，灭菌纯水冲洗3次，50粒/组置于9 cm培养皿中（1.5%脂、水培养基做床），置于恒温培养箱中25 ℃，相对湿度 60%暗培养，24 h后开始记录，记录频率为24 h/次。

超声诱导实验：取适量经预处理的防风种子，置于5 cm×10 cm加厚自封袋（袋中以灭菌水为超声传输介质浸泡种子）做超声诱导处理。待超声诱导处理完毕，再以75%乙醇溶液浸泡20 s，同时灭菌纯水冲洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，灭菌纯水冲洗3次，50粒/组置于9 cm培养皿中（1.5%琼脂、水培养基），置于恒温培养箱中25 ℃，相对湿度 70 %暗培养，24 h后开始记录，记录频率为24 h/次，连续3 d无发芽视为实验终止。

2.2 单因素分析

2.2.1 超声时间

温水浸种1 d （40 ℃），再将种子浸泡于灭菌水介质中，超声功率80 W，超声水浴温度40 ℃，超声频率40 Hz，研究不同超声时间5、10、15、20、25 min对种子发芽率的影响。

2.2.2 超声功率

温水浸种1 d （40 ℃），再将种子浸泡于灭菌水介质中，超声时间15 min，超声水浴温度40 ℃，超声频率40 Hz，研究不同超声功率40、60、80、100 W对种子发芽率的影响。

2.2.3 超声水浴温度

温水浸种1 d （40 ℃），再将种子浸泡于灭菌水中，超声时间15 min，超声功率80 W，超声频率40 Hz，研究不同超声水浴温度30、35、40、45、50 ℃对种子发芽率的影响。

2.2.4 浸种时间

种子浸泡于灭菌水介质中，超声时间15 min，超声功率80 W，超声水浴温度40 ℃，超声频率40 Hz，研究不同浸种时间0、1、2、3 d对种子发芽率的影响。

2.2.5 超声频率

温水浸种1 d （40 ℃），再将种子浸泡于灭菌水介质中，超声时间15 min，超声功率80 W，超声水浴温度40 ℃，研究不同超声频率40、60、80、100 Hz对种子发芽率的影响。

2.3 PBD 析因实验

以单因素实验为基础，防风种子发芽率为响应值，对超声时间、超声功率、水浴温度、超声频率和浸种时间这5个因素进行分析和评价，PBD析因实验共12组，其因素水平见表1。

2.4 实验优化

结合BBD对PBD实验筛选出的关键性影响因素进一步进行响应面的三因素三水平的优化和分析。

2.5 防风种子相关播种指标的测定

千粒质量（g）采用电子天平称取。

发芽率=（发芽总数/供试种子数）×100%。

发芽势=（7 d内发芽总数max/供试种子数）×100%。

发芽指数（Gi） = Σ Gt /Dt （Gt 为浸种t 后天的发芽数，Dt为相应的发芽天数）[14]。

2.6 微观结构对比与分析

为了能够更好地对比超声预处理和空白（CK）种子之间的差异，用扫描电镜（SEM）观察了防风种皮空间的微观结构。10 μm导电金溅射膜分别涂于样品表面，5.0 kV加速电压高真空环境下镜检。

2.7 数据处理

在研究过程中，所得实验数据均取实际数据的算术平均值±标准偏差。运用Origin 9.0软件处理单因素实验折线图，其中PBD因素筛选实验和BBD优化实验均通过Design Expert 8.0.6软件得以实现。

3 结果与分析

3.1 单因素影响实验

3.1.1 超声时间

在一定范围内超声时间对防风种子的发芽率具有一定程度的影响，如图1（a）所示。当超声时间不足20 min时，防风种子的发芽率会因超声时间的增加而得到较大程度的提升;当超声时间为20 min时，此时防风种子发芽率最高;当时间在20～25 min时，防风种子的发芽率开始变小。这主要因为，防风种子内部质膜会因超声时间过长而受到不可逆转的损伤，超声时间过长对发芽起到抑制性作用[15]。因此以超声时间10～20 min进行分析优化。

3.1.2 超声功率

由图1（b）可知，适宜的超声功率对防风种子的发芽率具有一定程度的促进作用。当超声功率低于80 W时，防风种子的发芽率会因超声功率的加强而得到较大程度的提升;当超声功率为80 W时，此时防风种子发芽率最高;当处理功率在 80～100 W时，防风种子的发芽率开始有走低的现象发生。主要原因在于，高强度的超声作用会使得防风种子内部质膜受到非逆转性的损伤，高强度超声作用对发芽起到抑制性作用[16-17]。选择40～80 W范围进行下步优化。

3.1.3 超声水浴温度

由图1（c）分析得出，适宜的超声水浴温度可以促进防风种子的发芽。当超声水浴温度低于40 ℃时，防风种子的发芽率会因超声水浴温度的升高而得到较大程度的提升;当超声水浴温度为40 ℃时，此时防风种子发芽率的提升幅度最大;当水浴温度在 40～50 ℃时，种子的发芽率开始有降低的趋势发生。主要原因在于适宜的超声水浴温度，有利于提高防风种子自身的持水性，种子活性得到加强，进而种子的发芽率会得到提升[17]。因此以30～40 ℃范围进行工艺的优化研究。

3.1.4 超声频率

超声频率对防风种子的发芽特性具有显著的影响，适宜的超声频率对防风种子有助于发芽。由图1（d）可知，当超声频率低于40 Hz时，防风种子的发芽率会因超声频率的增加而呈递增的趋势;其中以超声频率为40 Hz时，防风种子的发芽率处于最佳值;当超声频率为40～100 Hz时，防风种子在该频率范围影响的情况下，会因超声频率过高而呈递减的趋势。主要原因在于，防风种子会因超声频率过高，其内部结构会受到永久性损伤;适当低频范围内超声处理对防风种子的发芽具有一定程度促进效应，反之频率过高会变为抑制[18]。因此以频率20～40 Hz进行工艺的优化研究。

3.1.5 浸种时间

浸种时间对防风种子的发芽特性影响显著，适当的浸种有利于种子的发芽。由图1（e）可知，当浸种时间少于2 d时，防风种子的发芽率会因浸种时间的延长而呈递增的趋势;其中以浸种时间为2 d时，防风种子的发芽率处于最佳值;当浸种时间为2～3 d范围时，防风种子会因浸种时间过长而呈递减的趋势。原因在于，适宜的浸种处理可以与所浸溶液进行物质循环，会使得溶液中对植物生长调节和营养消耗有帮助作用的物质（无机盐离子、小分子物质）通过渗透作用进入种子内部，最终影响植物种子的发芽及各项生理代谢活动[19]。因此以浸种1～2 d区间进行工艺的优化研究。

3.2 PBD关键因素的筛选

PBD实验是对研究过程中各影响因素进行高低两水平设计，通过对比分析两水平因素存在的差异与实验整体差异二者之间的关系，进而实现判定因素的显著性，最终能够快速、有效地完成影响因素的筛选[20-21]。因此，在单因素实验数据的基础上，对超声时间（X1，min）、超声功率（X2，W）、水浴温度（X3，℃）、超声频率（X4，Hz）和浸种时间（X5，d）进行PBD关键因素筛选，PBD编码、实验值、方差分析（ANOVA）、贡献率和拟合统计见表1—表4。

由表3、表4和图2分析可知，根据各影响因素所对应F分布可以得出影响防风种子发芽率因素影响程度由大到小依次为：X1、X2、X3、X4、X5。其中，X1 （P < 0.01）对防风种子发芽率影响表现为差异性极显著;X2、X3 （0.01<P<0.05）为差异性显著。筛选出关键因素X1 、X2 、X3 ，进行BBD响应面的设计、优化和分析。R2=0.912 1、调整 R2 =0.838 9筛选拟合和线性程度高，预测值为91.21%，矫正系数为83.89%。为了能够更好地完成实验，将X4和X5分別定值为40 Hz和2 d（图2中T值为对应T检验值）。

3.4 关键因素的优化

优化实验对应BBD编码、实验值、方差分析（ANOVA）和拟合统计见表5—表8。

应用响应面Design-Expert V 8.0.6 （State East），遵循Box-Behnken原则，对表5中3影响因素超声时间（min）、功率（W）、水浴温度（℃）进行优化。实验方案经过模型拟合、优化，最终得出对应回归方程：

Y =+67.92+1.77X1+0.68X2+0.43X3-0.53X1X2+0.55X1X3+0.38X2X3-3.21X12-2.64X22-5.95X32

对表7回归方程方差数据分析，影响响应值Y的影响因素为：X1、X2、X3，X1X2、X1X3、X2X3，X12、X22、X32。通过F可以判定各类型影响因素的影响程度，其中非组合性和组合性影响因素的影响程度分别为：X1>X2>X3，X1X3>X1X2>X2X3和X32>X12>X22;其中，X1、X12、X22、X32表现为差异性极显著（P<0.01），X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3为不显著（P>0.05）。失拟项差异性不显著（P>0.05），由此可以证实该组优化实验的模型具有较高的拟合度，吻合性好。

R2 = 0.955 3、调整 R2 = 0.897 9说明优化实验拟合模型的拟合和线性程度高，其预测值可达95.53%，矫正系数为89.79%。

图3为关键因素RSM设计和优化所对应的3D伞状图，通过分析3D伞状图可以确定优化关键因素的极值（最大、最小值）和中间值;下方2D平面等高线图能够在二维成像基础上呈现三维关系，可以起到确定预期响应水平变量的作用，进而确切、直观反映被优化因素对响应值Y（发芽率）的影响强度[20-21]。在优化实验数据基础上，以响应值Y为Z轴，其他2个因素分别为X轴和Y轴拟合建立模型，分析和研究3D伞状图时以其中一因素设定为定值0。

对图3（a）分析可知，在一定区间范围内防风种子的发芽率会因影响因素X1和X2的提升而得到相应程度的提高，当发芽率达到最大值后伴有走低现象发生，同时因素X1、X2之间交互作用为差异性不显著（P>0.05）。X1为16 min，X2为62 W，此时防风种子发芽率对应响应值增量（Δ）状态最佳。

同理，对图3（b）、图3（c）因素X1X3和X2X3分析，可以得出防风种子发芽率对应响应值增量（Δ）状态最佳时条件分别为：X1X3（16 min，35 ℃），X2X3（62 W，35 ℃），且X1、X3和X2、X3均为差异性不显著（P>0.05）。以3D伞状图与纵轴的坡度（倾斜程度），可以得出组合影响因素X1X2、X1X3和X2X3中各因素影响程度，X1>X2，X1>X3， X2>X3，最终X1>X2>X3，与表7分析结果吻合。

3.5 工艺验证性实验

应用Origin 9.0和Design Expert 8.0.6软件对实验数据系统性地处理、分析与研究，最终响应面拟合优化得出影响防风发芽各因素的最佳参数：超声时间16 min、超声功率62 W、水浴温度 35 ℃、超声频率40 Hz和浸种时间2 d，预期发芽率为68.21%，预期发生概率为98.70%。最终得出发芽率的算术平均值为65.66%，相对误差为3.74%，说明优化实验成立，数据有效。

3.6 防风种子相关播种指标

表9分析可知，最佳超声诱导条件实验组与空白组相比，其发芽率、发芽势和发芽指数均优于空白组，且发芽率最终提升了29.71%。说明适宜超声诱导处理对防风种子的萌发具有积极促进作用。

3.7 防风种皮微观结构对比与分析

超声处理防风种子过程中，种子的种皮结构发生了一系列变化。图4为10.0、15.0 k倍数情况下空白对照和超声诱导处理后种皮微观结构的扫描电镜对比分析图。由空白未处理的防风种皮扫描电镜图4（a）观察可知，未经超声处理情况下防风种皮较厚，种皮表面条纹裂隙被种皮分泌的挥发油性等物质填充（阻塞）[22]。种皮通透性不佳将会抑制种子生物活性，不利于种子自身与外界环境之间的物质循环、能量流动以及信息的传递（水分、空气、光照、温度）等，进而不利于种子的萌发。

当防风种子经过超声诱导处理后，图4（b）种皮条纹裂隙阻塞程度会因超声过程中所产生的“空穴效应”的作用得到较大程度的改善，进而种皮通透性得到改善。防风种子内有效物质（蛋白质、酶类）的生物活性会得到一定程度的提高，种子内部与外界环境之间的物质循环、能量流动以及信息的传递（水分、空气、光照、温度）等相应得到改善，因此适当的超声作用对防风种子的萌发具有积极促进的作用[23]。

4 结论与讨论

本研究以单因素实验为基础，采用PBD法对防风发芽的影响因素：超声时间、超声功率、水浴温度、超声频率以及浸种时间进行关键因素的筛选，得出关键因素超声时间、超声功率、水浴温度。再以关键因素中心点展开BBD设计和优化，最终优化得出最佳影响因素条件为：超声时间16 min、超声功率62 W、水浴温度 35 ℃、超声频率40 Hz和浸种时间2 d， 且预期发芽率和预期发生概率分别为68.21%和98.70%，该条件下防风种子发芽率为65.66%，相对误差为3.74%。

此外，又对防风种子相关播种指标（最佳超声条件组和空白组）进行了测定，得出超声诱导处理过的发芽率、发芽势和发芽指数均高于空白组，且发芽率最终提升了29.71%，说明适宜条件的超声诱导对防风种子的萌发具有积极促进作用。运用扫描电镜对最佳超声处理组电镜对空白组的防风种皮微观结构予以初步对比和分析，发现超声处理后的种皮的条纹裂隙阻塞、通透程度均得到较大程度改善，因此有利于种子内部与外界环境之间的物质循环、能量流动和信息的传递。进一步说明適当的超声作用对防风种子的萌发具有积极促进的作用。

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