发酵蓝靛果果汁酵母菌的筛选及香气成分分析

韩春然，毕海鑫，王鑫

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150028）

蓝靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis）是一种忍冬科忍冬属，富含丰富营养物质的浆果类植物[1]。风味独特，但口感酸涩，通常直接食用不宜被大众接受[2]，因此对蓝靛果深加工技术的研究能有效提高其经济价值。一株活力旺盛的酵母菌在自身代谢的同时还能产生糖类、多肽等多种功能性物质，利于果汁品质的改善并产生浓郁的香气[3]。目前，关于蓝靛果制品的报道已有蓝靛果酸奶、果酒、果酱等[4]，但国内外对酵母菌发酵蓝靛果果汁菌种的筛选及其芳香物质的分析却报道较少。由于蓝靛果的主要涩味来源是单宁，与人口腔内唾液蛋白黏膜反应可引起收敛感，单宁酶作为发酵产生的诱导酶，是降解单宁的关键性限制酶[5]，酶活力越高，越有利于改善果汁品质。此外，果汁的主要呈香物质酯类也是影响果汁风味的关键指标。因此，寻找一株单宁酶活力旺盛且产酯能力高的酵母菌应用于蓝靛果果汁的发酵具有重要意义。本研究从3种果酒酵母中筛选出一株单宁酶活力、产酯能力优良的酵母菌，综合色度、理化指标及感官评价进一步验证其发酵特性，并对3种酵母菌发酵蓝靛果果汁进行香气成分分析，为蓝靛果产品的研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果：产自七台河市勃利县；LA-DE、LA-EC、LA-FR果酒酵母：烟台帝伯仕自酿机有限公司；麦芽浸粉（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；没食子酸（分析标准品）：天津市光复精细化工研究所；没食子酸丙酯（分析纯）：哈尔滨市新春化工厂；柠檬酸、柠檬酸钠（均为分析纯）：天津市博迪化工股份有限公司；甲醇（分析纯）：山东禹王和天下新材料有限公司；绕丹宁（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

榨汁机（L18-Y926）：九阳股份有限公司；恒温摇床培养箱（ZHWY-2102C）：上海智城分析仪器制造有限公司；高压蒸汽灭菌器（YX280）：上海三申医疗器械有限公司；超净台（HD-920）：北京东联哈尔仪器有限公司；离心机（TD5A）：湖南凯达科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-5200）：上海元析仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪（6890-5973型）：美国安捷伦公司；数显pH计（HWS-26）：上海一恒科学仪器有限公司；酒精计（0～30 mL）：武强县威尔仪表厂；色差仪（CR-400）：日本Konica Minolta公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝靛果果汁样品的制备

蓝靛果解冻，去除采摘残留的果枝、果叶，挑选成熟度适宜、完整无损坏的果实清洗后于榨汁机搅拌打浆，使果实充分破碎。将匀浆用4层纱布过滤除杂，121℃灭菌20 min，冷却后接种发酵，发酵完成于4 000 r/min离心5 min，得到蓝靛果果汁，备用。

1.3.2 菌种活化与培养液制备

用接种针分别挑取少量3种酵母菌于5%麦芽浸汁培养基（121℃、20 min灭菌）中活化（36℃左右），按照3种酵母菌的最适生长温度，分别于恒温摇床培养箱培养48 h后，再分别接种于新鲜的5%麦芽浸汁培养基中，于最适生长温度培养48 h。将传代2次的菌液作为纯培养液（活化后的菌液浓度为107CFU/mL）。

1.3.3 酵母菌生长曲线的测定

无菌操作条件下，取216支试管，分成3组（每组72支试管），分别标记为DE、EC和FR组。各试管均分装5%麦芽浸汁培养基10 mL，121℃灭菌20 min，冷却后，将活化的酵母菌纯培养液按1%接种量接入各试管，摇匀后于3种酵母菌最适生长温度的恒温摇床培养箱中培养，每隔4 h取各组酵母菌培养液5 mL，稀释10倍，在560 nm下测定吸光值（OD值），以空白培养基为对照，观察3种酵母菌培养72 h的生长情况，每个试验平行3次，取平均值，根据OD值绘制酵母菌生长曲线。

1.3.4 单宁酶活力的测定

1.3.4.1 粗酶液提取

参考马如意[6]的方法略有改动。酵母菌发酵液4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集菌体。按缓冲液∶发酵液=1∶1（体积比）加入 pH 5.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，菌悬液即为粗酶液。

1.3.4.2 酶活力测定

依据没食子酸与甲醇-绕丹宁反应产生色团物质测定单宁酶活力[7]。依次将3支试管标记为对照、测试和空白。分别将没食子酸丙酯及粗酶液于40℃水浴中预热5 min～10 min。各试管均加入没食子酸丙酯溶液0.25 mL，空白管加pH 5.0缓冲液0.25 mL，测试管加粗酶液0.25 mL，对照管不加物质，3支试管40℃水浴5 min后均加入0.05 mo/L甲醇-绕丹宁0.3 mL，40℃水浴5 min，仅在对照管加粗酶液0.25 mL，再往各试管加入0.5 mol/L KOH溶液0.4 mL，40℃水浴5 min，最后取8 mL蒸馏水加入3支试管，于520 nm波长下测定反应混合物的吸光值，以蒸馏水为空白。以没食子酸标准溶液（40 μmol/L～260 μmol/L）作标准曲线。

上述条件下，每分钟没食子酸丙酯被单位体积粗酶液水解生成1 μmol没食子酸消耗的酶量为一个酶活力单位。酶活计算公式如下。

1.3.5 产酯能力的测定

利用皂化反应测定总酯含量[8]。于250 mL回流瓶中加入50 mL果汁样品，加2滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液滴定至粉红色为止，记录消耗NaOH标准滴定溶液的体积，再加入NaOH标准滴定溶液25 mL并放2颗～3颗沸石，于沸水浴冷凝回流30 min，冷却后，用0.1 mol/L H2SO4标准滴定溶液滴至微红色消失即可，记录H2SO4标准滴定溶液的消耗量。用40%无酯乙醇溶液做空白，操作同上。总酯含量计算公式如下。

式中：X为样品总酯的质量浓度（以乙酸乙酯计），g/L；c 为 H2SO4标准滴定溶液浓度，mol/L；V0为空白试样消耗H2SO4标准滴定溶液的体积，mL；V1为样品消耗H2SO4标准滴定溶液的体积，mL；88为乙酸乙酯摩尔质量，g/mol；50 为样品量，mL。

1.3.6 色度的测定

采用色差仪测定果汁样品的色度，L*明暗度（0

1.3.7 发酵果汁理化指标测定

总酸、残糖参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]测定；酒精度采用酒精计测定；pH值采用pH计测定。

1.3.8 挥发性香气成分的测定

1.2 方法 采集肘静脉血2 ml冷冻保存，统一送检，用于血常规的检测，项目包括细胞计数、血红蛋白(Hb)含量、红细胞压积、红细胞平均体积、红细胞平均Hb含量及红细胞平均Hb浓度。经过查阅文献、专题讨论、专家评阅等过程设计统一的问卷调查表，主要内容包括儿童性别、年龄、出生体质量、喂养的方式、消化功能、辅食添加时间、妊娠期贫血情况、父母亲的文化程度、家庭饮食习惯、铁制剂服用情况、家庭收入、居住地等。

1.3.8.1 样品萃取条件

取30 mL果汁样品于40 mL进样瓶中，加入2 g氯化钠，60℃水浴平衡15 min，将老化好的DVB/CAR/PDMS提针插入进样瓶（老化时间5 min），使进样瓶的顶空气体触碰到石英纤维头，60℃恒温萃取40 min，将纤维头用手柄推回针头后拔出，插入气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用进样器，在250℃下解析1 min，同时开始采集数据。

1.3.8.2 色谱条件

色谱柱为 DB-5（60 m×0.25 mm，0.25 μm），采用程序升温：从室温（21℃）升到100℃保持5 min，再以5℃/min的速度升到250℃，保持5 min，无分流进样。进样口温度为250℃，载气氦气的流量为1.0 mL/min。

1.3.8.3 质谱条件

225℃时进行MS离子源全扫描，电离方式：电子电离（electron Ionization，EI），电子能量 70 eV；扫描质量范围：50 amu～500 amu。

1.3.9 感官评价

评价小组由10人组成，从香气、口味、外观3个方面，共9项指标对果汁进行感官评价。每项指标为0～10分，分数由高到低表示各指标的强弱程度，小组平均分为最终得分，评价指标及说明见表1。

表1 发酵蓝靛果果汁感官评价指标及说明Table 1 Indexes for sensory evaluation of fermented Lonicera edulis fruit juice

1.4 数据处理

利用Excel 2019软件对试验数据统计整理后通过Origin 8.5软件作图，利用IBM SPSS Statistics 24软件进行显著性分析（p<0.05），将分离得到的挥发性组分对应质谱检索分析，采用峰面积归一化法定量。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的生长曲线

酵母菌的生长曲线见图1。

图1 3种酵母菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of three different yeast strains

由图1可知，3种酵母菌生长趋势大体一致，从OD值变化可知，3种酵母菌的迟滞期均为接种后的0～4 h，32 h后进入衰亡期。不同酵母菌在迟滞期内的活性不同，LA-DE在迟滞期内的活性最高，对数生长期为4 h～20 h，发酵20 h后吸光度达到最高并趋于稳定，进入稳定期。LA-EC与LA-FR的生长趋势相似，对数生长期为4 h～24 h，稳定期为24 h～32 h，二者均于28 h时达到最高吸光度。与LA-EC、LA-FR相比，LADE到达稳定期的时间最短、稳定期最长，发酵过程平稳，经以上分析初步判断，酵母菌LA-DE具有优良的发酵潜质。

2.2 单宁酶活力的变化

单宁酶活力的测定首先进行标准曲线的绘制。本研究以没食子酸作为标准参照，标准曲线见图2。

图2 没食子酸标准曲线Fig.2 Standard curve for gallic acid

单宁酶可以催化单宁及没食子酸酯类的酯键、缩酚键生成没食子酸、葡萄糖及其他化合物[10]。以液体培养基为原料进行酶活力测定有利于控制发酵条件，降低杂菌的污染几率，可随时监测酶活力。3种酵母菌单宁酶活力比较见图3。

图3 3种酵母菌单宁酶活力的比较Fig.3 Comparison of tanninase activity of different yeast strains

由图3可知，3种酵母菌于蓝靛果果汁培养液的单宁酶活力均高于麦芽浸汁培养液。这可能是由于在相同条件下，不同培养液中酵母菌产酶的诱导物不同[11]，导致单宁酶的表达情况不同，因此酶活力也有所差异，LA-DE于麦芽浸汁培养液和蓝靛果汁发酵液中的酶活力分别达到3.99 U/mL和8.23 U/mL，显著高于其它两种酵母菌（p<0.05），说明LA-DE产酶水平较高，稳定性较好。蔡淑娟等[12]在产单宁酶酵母菌的筛选研究中，其菌株FC6-1的单宁酶活力为2.86 U/mL，与本试验存在差异，原因可能是菌株不同，单宁酶活力有所不同，另外，反应体系也有所不同（菌株FC6-1的反应体系为单宁酸液体发酵培养基）。因此，单宁酶活力受菌株和底物影响较大。

2.3 产酯能力的变化

3种酵母菌产酯能力见图4。

图4 3种酵母菌产酯能力的比较Fig.4 Comparison of ester production capacity of different yeast strains

由图4可知，3种酵母菌于蓝靛果果汁培养液的产酯效果均显著（p<0.05）高于麦芽浸汁培养液。这可能是由于酵母菌对麦芽浸汁培养液中营养元素的利用率较低，从而菌株的生长发酵在一定程度上受到抑制，产酯能力也有所降低，说明酵母菌发酵有利于增加蓝靛果果汁风味物质。蓝靛果果汁培养液中，LADE的产酯能力最为突出，其总酯含量达到4.07 g/L，高于LA-EC和LA-FR产生的总酯含量。李棒等[13]在高酸度水果果酒优良产酯酵母菌株的鉴定中得到的菌株E3（Wickerhamomyces anomalus）的产总酯能力最高能达到3.91 g/L，与本研究结果接近。

2.4 色度分析

有研究指出，酵母细胞壁对色素分子具有吸附作用，且酵母菌能够与果汁中颜色物质反应[14]，因此酵母菌的种类对果汁色泽有直接影响。3种酵母菌发酵蓝靛果果汁的色度指标见表2。

表2 酵母菌发酵蓝靛果果汁色度分析Table 2 Colority of Lonicera edulis fruit juice fermented by different yeast strains

由表2可知，LA-DE发酵蓝靛果果汁的L*显著高于其余两组（p<0.05），这可能是因为色素变化使果汁的褐变程度较小，亮度值较高。LA-EC与LA-DE发酵果汁的a*显著高于LA-FR（p＜0.05），这是由于发酵使得蓝靛果果汁酸度值增加，整体呈趋偏红势，果汁颜色最终为紫红色。3种果汁样品的b*之间无显著差异（p＞0.05），可能与多酚类物质有关，酵母菌发酵促进了多酚类物质的释放和聚合色素的产生，聚合产物和褐变反应赋予了果汁黄色色调[15]。

2.5 理化指标分析

酵母菌发酵蓝靛果果汁的各项指标结果见图5。

图5 酵母菌发酵蓝靛果果汁理化指标分析Fig.5 Analysis of physical and chemical indexes of Lonicera edulis fruit juice fermented by yeast strains

不同酵母菌利用糖类物质代谢产酸的能力不同，部分酸类物质在发酵过程中作为中间代谢产物转化为其他物质（如酯类）的能力也不同[16]。如图5所示，对比分析3个果汁样品，LA-FR的总酸含量低于其他两种酵母菌，为11.50 g/L。可能是因为LA-FR分解代谢速率迟缓，酸类物质发酵不完全。残糖量为4.6 g/L～6.0 g/L，LA-DE的残糖量最低，说明LA-DE对糖的代谢转化率高，发酵能力较强，发酵过程平稳。LA-DE、LA-EC、LA-FR3种酵母菌发酵果汁的酒精度分别为2.5、1.6、0.9% vol，由于酵母菌以糖类为底物发酵产生酒精[17]，所以酒精度的不同会受到酵母对果汁中碳水化合物的利用率所影响。而pH值则是影响酶活性、酵母新陈代谢的重要因素，3种果汁中LA-FR发酵果汁的pH值最高，达到3.28，这一结果与其酸性含量一致，说明该果汁中酵母的发酵不够理想。

2.6 感官评价

酵母菌发酵蓝靛果果汁的感官雷达图如图6。

图6 酵母菌发酵蓝靛果果汁感官评价雷达图Fig.6 Radar chart of sensory evaluation of Lonicera edulis fruit juice fermented by different yeast strains

由图6可知，LA-DE酵母菌发酵果汁总体感官评分最高，为9.7分，果香味突出，口感柔和无收敛感，果汁呈紫红色且色泽明亮，产酸能力最强，产香增鲜的能力突出，有淡淡的蓝靛果香及醇厚的发酵香，这是因为LA-DE产总酯能力及单宁酶活力较高，发酵性能及稳定性较好；其次是LA-EC发酵果汁，总体评价得分8.5分，酸甜适中，澄清度最佳，略有涩味和后味；LA-FR发酵果汁得分最低，由于其产酸能力弱且a*值相对较低，总体风味寡淡呈淡紫色，发酵香及果味微弱，略有后味残存于喉咙，可见少量沉淀。3种果汁均无特殊异味，说明酵母菌发酵对蓝靛果果汁品质有一定增强作用。

2.7 挥发性香气分析

通过GC-MS对3种酵母菌发酵蓝靛果果汁的香气成分鉴定结果如表3所示。

表3 发酵蓝靛果果汁挥发性香气成分及相对含量Table 3 Volatile aroma components and relative content in fermented Lonicera edulis fruit juice

续表3 发酵蓝靛果果汁挥发性香气成分及相对含量Continue table 3 Volatile aroma components and relative content in fermented Lonicera edulis fruit juice

由表3可知，LA-DE共检测出香气组分41种，LA-EC和LA-FR分别检测出香气组分25种和27种，3种果汁共有香气物质为17种，主要组分均为酯类。冯隽野等[18]对发酵蓝靛果浆和果汁中种挥发性成分的研究中发现主要挥发组分均是酯类，与本研究结果相似。

2.7.1 酯类物质分析

酯类可赋予果汁特殊的花果香，3种酵母菌中LADE发酵果汁酯类较丰富为20种，癸酸乙酯和辛酸乙酯为3种果汁共有酯类，相对含量均较高，呈甜香、葡萄香和白兰地香。其它低含量酯类也能辅助果汁呈香，如己酸乙酯赋予果汁曲香和菠萝香。杨旭等[19]对果汁和带渣两种方式发酵“蓓蕾”蓝靛果酒中香气分析发现，主要酯类为辛酸乙酯和癸酸乙酯，癸酸乙酯是发酵蓝靛果的典型香气物质，与本文发酵蓝靛果果汁的研究结果一致。

2.7.2 醇类物质分析

果汁中的醇类可能来源于两方面，一是通过酯类和糖苷类前体分解获得，二是酵母菌的发酵代谢产生[20]。3种果汁中均检测出苯乙醇和正戊醇，其中苯乙醇是影响果汁香气的最主要醇类，具有独特的玫瑰香，有一定的杀菌作用。周雪艳等[21]也发现影响鸭梨酒挥发性成分的主要醇类为苯乙醇，赋予梨酒特殊的香气。

2.7.3 酸类物质分析

酸类在发酵蓝靛果果汁中具有协调和平衡作用，酵母菌在发酵过程中繁殖代谢产酸[22]。LA-EC发酵果汁中酸类占总香气的8.36%，LA-DE的酸类组分占比为23.80%，LA-FR的酸类物质占总峰面积的14.64%，对果汁品质有积极贡献的有机酸均为辛酸和正癸酸，赋予果汁桃子味、草莓味和奶酪味等多种风味。

2.7.4 烷烃类、酚类、醛酮类物质分析

3种果汁中共检测出烷烃类7种、酚类2种、醛酮类物质3种，其中LA-FR中未检测出酚类及醛酮类物质。LA-DE发酵果汁中含量较高的苯甲醛赋予果汁怡人的坚果香；其酚类占香气组分比例最小，4-乙基苯酚相对含量最多，香气甜润。杨华等[23]在红豆越橘果汁中检测共41种香气成分，对果汁香型贡献最大是醇类和酯类，其次是酸类，还有少量烷烃类、烯类、醛酮类及酚类，这些组分共同影响果汁的整体风味结构。与本文的研究结果相似。

3 结论

通过测定LA-DE、LA-EC、LA-FR3种酵母菌的生长曲线，比较分析3种酵母菌发酵蓝靛果果汁时的单宁酶活力和产酯能力，初步确定LA-DE酵母菌具有较好的发酵潜质。综合色度、理化指标及感官评价考察了3种酵母菌的发酵性能。结果表明，LA-DE发酵果汁具有浓郁的果香及发酵香，无收敛感，色泽稳定呈明亮的紫红色，酒精度为2.5% vol。采用GC-MS对3种酵母菌发酵蓝靛果果汁进行香气成分分析，LADE发酵果汁检测出香气组分41种，LA-EC和LA-FR分别检测出香气组分25种和27种，包括酯类、醇类、酸类及少量烷烃类、酚类和醛酮类。综合分析选择LA-DE作为发酵蓝靛果果汁的最优酵母菌，其主体香气成分为癸酸乙酯、苯乙醇和辛酸，各种香气组分相互协调，共同赋予发酵蓝靛果果汁特征性风味。