响应面法优化紫大薯花青素超声辅助提取工艺

陈俊朴，周璐彤，云颖，喻赫，李金华，王学梅，石惠宇

（海南大学动物科技学院，海南 海口 570100）

紫大薯又名紫参薯、紫山药、脚板薯，属于薯蓣科，具有丰富的蛋白质、单糖、二糖和人体必需的矿物质元素，并且其营养成分因种植地区之间的差异而表现不同[1]。紫大薯所拥有的丰富的营养价值使其在一些地区被作为主食。刘影等[2]经研究发现，浙江紫山药有着低脂肪、低热量、高蛋白、蕴含多种矿物质元素的特点，并且有着丰富的花青素、多糖，开发潜力巨大。

近年来，花青素的生物利用价值越来越被人们所熟知，其拥有的较强抗氧化功能在各种学术期刊上被报导。花青素在动物体内起到抗衰老、抗炎、抗菌、保护肝脏、调节代谢等重要作用[3]。研究者通过相关研究证实了花青素的生物学功能，并将其运用到动物体内，研究其抗氧化能力和代谢调控能力[4]。Aboonabi等[5]通过研究花青素在代谢综合征患者中的代谢调控效果，发现花青素可以显著降低心脏代谢性疾病患病风险，且可以减少因代谢综合征形成的血栓。

从植物中提取花青素已经经历了多年的研究，提取方法有固液萃取法[6]、微波辅助提取法[7]、超声辅助提取法[8]、微波-超声协同辅助提取法[9]、超临界萃取法[10]等。在花青素的提取过程中，提取量受到提取液类型、提取液酸碱度、温度、提取时间等因素的影响[11]。花青素具有较强的极性，可以使用水或亲水性的乙醇、甲醇等有机溶剂进行提取。刘超等[12]通过研究不同提取溶剂对提取花青素含量的影响，发现10%乙酸提取的花青素含量高达（150.01±0.13）μg/mL，显著高于0.50%硫酸、1.50 mol/L盐酸、0.80%柠檬酸、95%乙醇。由于花青素本身易于分解，在提取过程中一般会通过酸化提取液来减少花青素降解，考虑安全因素，通常选择使用盐酸或柠檬酸对其进行酸化，以提高花青素稳定性和提取量。

花青素的获取途径大多是紫薯、黑枸杞、蓝莓、桑葚等。郝文博等[13]通过响应面优化超声辅助提取蓝莓花青素工艺，得到最佳蓝莓花青素提取率为6.51%。程秀玮等[14]研究表明，超声波辅助提取桑葚花青素，提取量经优化后最高可达到5.09 mg/g。徐颖等[15]研究发现，超声波辅助酶法提取紫薯花青素经响应面优化后提取量达到2.00 mg/g。从紫大薯中获取花青素的相关研究较少，并且紫大薯中所含花青素含量相对黑枸杞、蓝莓等低，甘学德[16]通过研究49份不同品种甘薯资源发现，紫大薯花青素含量普遍较低，并且不同品种之间差异较大，27种紫大薯花青素含量跨度为18.09 mg/100 g～93.09 mg/100 g。

紫大薯花青素提取量低为试验带来诸多不便，使紫大薯中花青素资源开发较难。解决紫大薯中花青素提取量低的问题，是保证后续试验能够顺利开展的重要基础，一种高效简便的紫大薯花青素提取方案将极大提高紫大薯花青素的开发和利用速度。本文为提高紫大薯花青素提取量，采用响应面法对提取条件进行优化，以探索紫大薯花青素最佳提取条件，为更好更快开发和利用紫大薯花青素资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜紫大薯：海南大学薯蓣基地；盐酸、无水乙醇（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TopPette手动单道可调移液器（100μL～1000μL）：大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；紫外可见分光光度计（UV-5100型）：上海元析仪器有限公司；超声清洗仪（KX-1730T型）：北京科玺世纪科技有限公司；鼓风干燥箱（DHG-9245A型）：上海一恒科学仪器有限公司；循环水真空泵[SHZ-D（Ⅲ）型]：巩义市予华仪器有限责任公司；高速万能粉碎机（FW100）：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

本试验采用超声辅助提取法[17]提取花青素。将新鲜紫大薯洗净后切片置于鼓风干燥箱中45℃烘干，烘干后用高速万能粉碎机打碎过80目筛，于4℃保存待用。花青素提取液采用无水乙醇∶超纯水=2∶1的体积比配制，用盐酸进行酸化处理。

1.3.2 单因素试验设计

以提取液盐酸体积分数、超声时间、料液比3个条件进行单因素分析。设置料液比为 1∶5、1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），提取液盐酸体积分数 0.25%，超声30 min，静置提取1.5 h，过滤取滤液，测定滤液中花青素含量，计算紫大薯花青素提取量；设置提取液盐酸体积分数为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、2.00%，料液比1 ∶20（g/mL），超声 30 min，静置提取 1.5 h，过滤取滤液，测定滤液中花青素含量，计算紫大薯花青素提取量；设置超声时间为 10、20、30、40、50 min，提取液盐酸体积分数 0.75%，料液比 1∶20（g/mL），静置提取 1.5 h，过滤取滤液，测定滤液中花青素含量，计算紫大薯花青素提取量。

1.3.3 花青素提取量计算

采用pH示差法测定花青素含量。花青素提取量计算公式如下[18]。

式中：A 为（A520nm-A700nm）pH1.0与（A520nm-A700nm）pH4.5差值；M为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷摩尔质量，449.2g/mol；DF为稀释倍数；e为摩尔消光系数，26900 L/（mol·cm）；l为光程，cm；V为提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.4 响应面试验设计

基于单因素试验结果进行三因素三水平响应面试验，试验因素水平如表1所示。

表1 响应面法优化的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.4 数据处理

各试验重复3次，使用SAS 9.4对试验数据进行分析处理，使用origin2021b绘图，使用Design Expert 10进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对紫大薯花青素提取量的影响

料液比对紫大薯花青素提取量的影响见图1。

图1 料液比对紫大薯花青素提取量的影响Fig.1 The effect of soil-liquid ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

由图1 可知，料液比在 1 ∶5（g/mL）～1 ∶20（g/mL），花青素提取量随溶剂量的增多而提高，在1∶20（g/mL）～1 ∶25（g/mL）出现小幅度下降趋势，且在 1 ∶5（g/mL）～1 ∶15（g/mL）花青素提取量增长较快，在 1 ∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）增长、下降幅度较小。因此选择料液比1 ∶20（g/mL）进行后续试验。

2.1.2 盐酸体积分数对紫大薯花青素提取量的影响

盐酸体积分数对紫大薯花青素提取量的影响见图2。

图2 盐酸体积分数对紫大薯花青素提取量的影响Fig.2 The effect of hydrochloric acid content on the extraction efficiency of anthocyanin

由图2可知，提取液中盐酸体积分数在0.25%～0.75%时花青素提取量上升较快，在0.75%～2.00%提取量开始下降，且在0.75%～1.00%之间下降最快，从1.00%～2.00%之间下降较为平缓。因此选择盐酸体积分数0.75%进行后续试验。

2.1.3 超声时间对紫大薯花青素提取量的影响

超声时间对紫大薯花青素提取量的影响见图3。

图3 超声时间对紫大薯花青素提取量的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of anthocyanin

由图3可知，超声时间10 min～20 min提取量上升较快，超声时间20 min～50 min提取量开始下降，且在30 min～40 min下降最快。因此选择超声时间20 min进行后续试验。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面设计结果

响应面试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

以料液比、盐酸体积分数、超声时间为试验因素，紫大薯花青素提取量Y为考察指标，得到回归方程为Y=89.56+6.26A-10.00B-2.85C-0.76AB+2.08AC+0.66BC-6.46A2-10.85B2-8.20C2。

回归模型方差分析见表3。

表3 响应面设计回归方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quad ratic model

由表3可知，该模型的相关系数R2为0.973，表明试验结果与预测值之间差异较小。该响应面回归模型达到极显著水平（p<0.01），表明该二次模型能够拟合实际结果，误差较小。在三因素三水平的范围内，对花青素提取量产生影响的因素顺序为盐酸体积分数、料液比、超声时间。并且 A、B、A2、B2、C2对花青素提取量产生极显著影响（p<0.01），C对花青素提取量产生显著影响（p<0.05），而 AB、AC、BC 对花青素提取量的影响不显著，说明料液比、盐酸体积分数、超声时间之间的互相作用对花青素提取量影响不大。

2.2.2 响应面和等高线图结果

各试验因素交互作用的响应面和等高线图见图4。

图4 各试验因素交互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由图4可以看出，料液比、盐酸体积分数、超声时间3个因素对花青素的提取量均具有显著影响，但是3个因素之间交互作用程度不显著。其响应面图曲面的坡度可以反映随着因素变化导致提取量改变程度大小，从等高线图则能看出其因素之间交互作用的显著程度。

根据软件计算结果，得到紫大薯花青素最佳提取条件为料液比1∶22.50（g/mL）、盐酸体积分数0.63%、超声时间18.69 min。在此条件下，预测花青素最佳提取量为93.70 mg/100 g。考虑实际操作可行性，进行验证时将提取条件修正为料液比1∶22（g/mL）、盐酸体积分数0.63%、超声时间19 min。进行3次重复试验验证预测结果，结果表明在该提取条件下花青素的提取量为93.62 mg/100 g，相比预测值，相对误差为0.08%。

3 讨论与结论

在本次试验中，盐酸体积分数在0.63%时达到最佳，盐酸不足或过量都会导致花青素提取量下降，这与葛艳琳[19]在研究桑葚花青素提取过程中所得到的结果相一致。最佳料液比为1∶22（g/mL），提取液较少时会导致紫大薯与提取液无法充分接触，提取效果较差。在张卉等[20]的研究结果中，黑果腺肋花楸花青素提取过程中也出现提取量随着提取液量的提高而提高，提取量达到最大值后继续增加提取液量则会产生一个较低的损失量。随着超声时间的延长，花青素提取量达到最大值，然后继续延长超声时间则出现提取量降低的现象。在谢丹等[21]、刘晓娜等[22]的研究中也出现类似情况，这种现象可能是由于在较长持续时间下超声导致的局部高热破坏了花青素的结构，使其发生了降解，最后表现出的结果为提取量下降。

本试验通过响应面法对紫大薯花青素提取量进行了优化，优化结果表明最佳提取条件为料液比1 ∶22（g/mL）、盐酸体积分数 0.63%、超声时间 19 min，在此条件下花青素提取量为93.62 mg/100 g，相比优化前提取量有着显著性提高。本次试验优化了紫大薯花青素提取量，能够更加高效快捷进行花青素提取，为今后更好开发海南紫大薯花青素资源奠定基础。