基于lncRNA-mRNA共表达网络的HBV相关肝癌生物靶点筛选及综合分析

农顺强,陈晓昊,许桂丹,韦武均,彭 彬,周 律,邓益斌

0 引 言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一，其发病率居全球第六位、死亡率居第四位[1]。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是大多数高危HCC地区的主要危险因素。大量研究表明，HBV参与肝细胞的癌变、侵袭和转移，在肝癌的发生发展中起着至关重要的作用[2-4]。由于缺乏特征性临床表现，HCC的大部分诊断多处于晚期，预后较差。尽管一些文献报道了一些用于早期诊断的血清生物标志物，但结果并不十分令人满意[5-7]。因此，探求新的早期发现与早期干预标志物，对于改善肝癌患者预后和提高其长期生存率尤为重要。长链非编码RNA(lncRNA)一般是指长度大于200个核苷酸(nucleotide, nt)，缺乏或者仅有微弱蛋白编码能力的RNA[8-9]。LncRNA已经被证实在HBV相关肝细胞癌发生中起着至关重要的作用[10]，然而，关于lncRNAs作为预测性生物标志物和治疗靶点的研究仍然非常有限。本研究利用生物信息学方法，筛选出在HBV相关肝癌和癌旁组织差异表达的 lncRNA 和mRNA，探究候选lncRNA在肝癌发生、发展进程中的作用机制；对筛选出的lncRNA进行qRT-PCR验证及受试者工作曲线(ROC)的分析，为进一步揭示HCC的发病机制提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2019年2月至2020年12月右江民族医学院附属医院肝胆外科及体检科患者。肿瘤组(n=45)为HBV阳性原发性肝癌患者，其中男35例、女10例，年龄(52.2±8.3)岁；对照组(n=58)为乙肝病毒携带无肿瘤患者，其中男38例、女20例，年龄(51.0±8.4)岁。2组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理学委员会批准(批准号：2019012601)，患者均签订知情同意书。从美国国立生物技术信息中心的GEO数据库中，获取3个HBV相关肝癌芯片表达数据集GSE55092、GSE19665和GSE84402。其中GSE55092包括49例肝癌和91例癌旁正常样本，GSE19665包括肝癌和癌旁正常样本各5例，GSE84402包括肝癌和癌旁正常样本各13例，作为差异基因的筛选集。

1.2筛选差异表达基因从Affymetrix官方网站(www.affymetrix.com)下载芯片探针序列FASTA格式文件，使用SeqMap工具将HG-U133_Plus_2芯片的探针序列与GENCODE的人类基因组(GRCh38)(https://www.gencodegenes.org/)(release 30)和lncRNA基因序列进行比对，获取非编码RNA(non-coding RNA)和信使RNA(mRNA)探针信息。使用R语言中的limma[11]包标准化数据，将肿瘤组与对照组比较，以差异倍数2倍(|logFC|>1)，P<0.05为标准，获取差异基因；使用R语言中RobustRankAggreg[12]包，根据差异倍数值对基因进行排序，并选出3个数据集中都存在差异表达的基因。

1.3 筛选HBV相关HCC的候选诊断lncRNA生物标志物为了筛选HBV相关HCC的最佳诊断lncRNA生物标志物，利用机器学习，通过使用随机森林分析进行特征选择，每个lncRNA的重要性根据平均基尼减少量(mean decrease gini, MDG)排序；通过十乘交叉验证，MDG值从大到小逐一添加差异lncRNA计算分类结果准确度来确定最佳特征数量。

1.4基因共表达分析、基因功能和通路富集分析根据基因表达值，计算所有筛选出的差异表达lncRNA与mRNA两两间的皮尔森相关系数，选取相关系数绝对值|r|>0.5,且校正后P<0.05的lncRNA和mRNA对，纳入共表达分析网络。利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)对共表达的差异基因进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，以P<0.05为富集标准。

1.5候选分子在肝癌患者血浆中表达量的验证利用qRT-PCR检测候选lncRNA在血浆样本的相对表达量，并检测肿瘤组及对照组病例的甲胎蛋白值。对有统计学差异的候选分子进行单个lncRNA或联合的ROC分析。qRT-PCR试剂为美国Thermo公司的反转录试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit及上海翊圣生物科技有限公司的荧光定量试剂Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix®，使用仪器为Lightcycler96荧光定量PCR仪及伯乐BIO-RAD T100TMThermal Cycler型PCR仪；甲胎蛋白的测定为美国雅培i2000SR及其配套试剂。

2 结 果

2.1 差异基因筛选根据筛选条件从表达谱数据集GSE55092, GSE19665和GSE84402中分别提取了103、333、158个差异表达的lncRNA和1182、2147、1579个差异表达的mRNA。根据差异倍数值，对3个数据集差异基因进行排序，然后对3个数据集进行RobustRankAggreg分析，总共从3个数据集中鉴定出38个差异lncRNA，包括25个上调的和13个下调的lncRNA，以及541个DEmRNA，包括195个上调的和348个下调的mRNA，见图1。

2.2基因共表达分析、基因功能和通路富集分析候选lncRNA与126个mRNA存在共表达，共199个mRNA-lncRNA共表达对。共表达mRNA的GO功能富集结果表明，表达失调的基因主要富集于与单羧酸代谢过程、类固醇代谢过程、细胞分裂、有丝分裂细胞周期过程、基底质膜、纺锤体极、基底外侧质膜、基底部分细胞、细胞外空间、纺锤体、辅因子结合、蛋白质同源二聚化活性、辅酶结合、小分子结合、相同蛋白质结合等181个GO条目。KEGG通路分析显示，差异基因主要富集在p53信号通路、视黄醇代谢、PI3K-Akt信号通路、化学致癌作用和过氧化物酶体等信号通路。见图2。

行代表差异基因，列代表样本(绿色和红色分别表示正常和肿瘤样品)

图 2 差异基因GO分析和KEGG分析结果Figure 2 The gene ontology along with the signal pathway enrichments

2.3候选分子在肝癌患者血浆中表达量的验证对通过数据挖掘挑选出的9个候选lncRNA,在血浆样本中进一步验证。EHMT2-AS1、AC093642.1在肿瘤组与对照组间差异无统计学差异(P>0.05)；AC003991.1、AL445524.1、LINC00844、AL56056.2、AC008040.1、TRIM52-AS1、LINC01018肿瘤组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，肿瘤组表达上调，见图3。ROC曲线分析结果显示，见表1，候选的7个lncRNA对HBV相关HCC的诊断均有一定的价值，其中LINC00844和LINC01018的曲线下面积(AUC)分别为0.851及0.850，具有较高的诊断价值(AUC>0.85), TRIM52-AS1、AC003991.1分类效果较好, AL445524.1分类效果较一般。甲胎蛋白的AUC为0.646(95% CI: 0.5333～0.7586)，见表1。

图 3 血浆中验证候选lncRNA的表达量

表 1 单个lncRNA诊断HCC的价值

采用逐步logistic回归分析，通过选择赤池信息准则(akaike information criterion, AIC)信息统计量最小来增减变量，AIC的方法是寻找可以最好地解释数据但包含最少自由参数的模型。结果显示，LINC01018、AC003991.1、AL445524.1及LINC00844可以作为联合判别HBV相关HCC的生物标志物。以4个lncRNA在血浆中的相对表达量值联合及与甲胎蛋白临床测量值联合作 ROC曲线分析，构建logistic回归模型，评价其对HBV相关HCC联合判别的能力。4-lncRNA联合构建logistic回归模型的AUC分别为0.910，敏感度和特异度分别为0.828、0.911； 4-lncRNA与甲胎蛋白联合构建logistic回归模型的AUC为0.986，敏感度和特异度分别为0.969、0.964。见图4。

图 4 4-lncRNA联合及与APF联合的ROC图

3 讨 论

肝癌是一种发病率及死亡率高的、常见的消化系统肿瘤。目前手术仍是肝癌常规的治疗手段，但基于其起病隐匿、侵袭性强、进展迅速且预后差，大多数患者确诊时已是中晚期，5年生存率低[13]。随着生物信息学的发展，为疾病诊断及治疗靶点的探究提供了新途径。本研究利用生物信息学方法筛选并验证了7个lncRNA在HBV相关HCC患者与对照组血浆间存在显著差异，在评估对HBV相关HCC的鉴别中，7个lncRNA都有一定的诊断价值；我们通过逐步逻辑回归方法确定将4个lncRNA联合及与甲胎蛋白联合来诊断HBV相关HCC，显示出较高的诊断效能。

研究发现EHMT2-AS1的变异与慢性乙型肝炎的风险有关[14-15]，其在HBV相关肝癌发生发展中的分子机制有待进一步研究。研究显示TRIM52-AS1的敲低可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化，并抑制体内肿瘤生长；机制研究表明，TRIM52-AS1通过ceRNA网络调控机制来影响HCC进展[16]。LINC01018靶向FOXO1竞争性结合miR-182-5p调节肝癌细胞的增殖及细胞凋亡[17]。此外，报道显示LINC01018通过LINC01018-hsa-miRNA-574-5p-葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基的ceRNA网络在HBV诱导的肝癌过程中具有关键作用[18]。文献表明，LINC00844通过调节药物代谢酶的表达影响药物代谢和毒性[19]，LINC00844在HCC中下调，与门静脉侵犯、高甲胎蛋白及高复发率等不良肿瘤特征相关，其过表达可使MAPK信号转导通路失活而显著抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭[20-21]。

本研究中除EHMT2-AS1、TRIM52-AS1、LINC01018及LINC00844外，其余lncRNA的相关生物学功能未见报道。鉴于lncRNA作用机制的研究多处于探索阶段，而lncRNA-mRNA的共表达分析是鉴定lncRNA潜在靶基因和进一步研究lncRNA生物学功能的常用方法[22]。故本研究构建lncRNA-mRNA的共表达网络，以预测HBV相关HCC的lncRNA潜在的生物学功能。在差异的mRNA中，STEAP3与AC003991.1、RRM2与AC093642.1、IGFBP3与AL445524.1存在共表达，并富集于p53信号通路。癌细胞因快速增殖需大量铁，STEAP3编码的蛋白质能调节细胞内铁储存并帮助肿瘤在缺铁环境中生长[23]。STEAP3可与STEAP4形成异二聚体，可影响金属稳态、细胞凋亡和细胞周期调控[24]，且AC003991.1是STEAP4反义链lncRNA。研究表明反义lncRNA可以通过与邻近基因形成RNA-RNA二聚体来提高mRNA的稳定性，提高基因的表达效率[25-26]。RRM2参与癌细胞的增殖、分化、转移和耐药性调节，在多种癌症高表达[27-30]。IGFBP3在多种肿瘤中的沉默，过表达IGFBP3可诱导细胞凋亡并抑制细胞存活和生长[31-32]。血清IGFBP3水平与HCC发病率呈正相关[33]，IGFBP3在HCC中的低表达与肿瘤大小、组织学分化、囊膜侵犯和门静脉侵犯相关[34]。本研究提示AC003991.1、AC093642.1和AL445524.1可能通过调节p53信号通路在HBV相关HCC的发生或发展中发挥重要作用。本研究中AC008443.1与CYP3A5共表达并富集于视黄醇代谢和化学致癌通路，提示其可能通过调节CYP3A5的表达或视黄醇代谢和化学致癌作用，参与HBV相关肝癌生发的调控。CYP3A5在多种肿瘤中异常表达，其异常表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关[35-36]。此外，CYP3A5可通过调节mTORC2/Akt信号通路抑制HCC的发病和转移，并可作为预后标志物[37-38]。

综上所述，本研究通过生物信息学方法，便捷、经济地筛选到HBV相关肝癌中差异表达的lncRNA，并通过实验验证。以上研究结果为HBV相关肝癌的诊断提供了新的潜在循环分子标记物，有助于肝癌的早期筛查和预防，为临床上寻找肿瘤新的治疗靶点提供了实验及理论基础。