狂犬病冻干灭活疫苗纯化与冻干工艺的建立

崔松奇，张文芳，张丹丹，余海涛，刘 洋，孔 敏，田春利

(豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700)

0 引言

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病，临床症状表现为恐水、恐光、狂躁不安等[1]。狂犬病病毒可感染犬、猫、狐狸等温血动物，人一旦感染，致死率几乎100%[2]。据估计，狂犬病流行于全球150多个国家，每年造成约59 000人死亡，其中95%的病例发生在非洲和亚洲[3]，其中亚洲占56%，非洲占44%。大多数死亡(84%)都发生在农村地区，其主要原因是对于犬狂犬病监管力度不足[4]。我国狂犬病全年都有流行，但相对集中于夏秋季节，主要是农民、学生、散居儿童发病较多。世界卫生组织( World Health Organization，WHO) 建议将犬类狂犬病疫苗接种率提高至 70%，以有效阻止狂犬病毒的传播[5]。大规模犬类免疫接种也是消除人类狂犬病的根本措施[6]。因此探索狂犬病病毒兽用疫苗制备工艺，研制安全高效价的兽用疫苗，从源头控制，以切断动物散毒途径，对控制人感染狂犬病病毒事件的发生具有重大意义。

1 材料

实验动物:昆明系小鼠，11～13 g，购自北京实验动物中心。

检验用强毒狂犬病固定毒巴黎株:代号AV2011，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

狂犬病参考疫苗标准品: 由豪威生物科技公司制备。

狂犬病疫苗效力检测试剂盒:购自武汉生物制品研究所。

β-丙内酯(BPL):Alfa-Aesar公司产品，纯度97%，批号:33672。

层析柱(Index Column 140/950)及配件:购自GE 公司。

柱材(Sepharose 4Fast Flow ):购自GE 公司。

UV检测器:购自GE公司。

经超滤浓缩50倍的抗原:由本公司生产车间提供。

0.2 m2冷冻真空干燥机:型号GZLY-0.2，购自奥特佳美科技有限公司。

15 m2冷冻真空干燥机:购自上海远东制造总厂。

2 方法

2.1 纯化试验

1)上样量优化试验:将灭活检验合格的50倍浓缩抗原分别以600 mL、960 mL和1 200 mL上样，固定洗脱流速102 mL/min不变，经Sepharose 4 Fast Flow (4FF)柱层析系统纯化，用紫外蛋白检测仪在280 nm波长下检测分离液，分步收集各洗脱峰。

2)洗脱流速优化试验:以试验中确定的最佳上样量进行上样，改变洗脱流速，分别以77 mL/min、102 mL/min和128 mL/min进行洗脱，用紫外蛋白检测仪在280 nm波长下检测分离液，分步收集各洗脱峰。

3)使用狂犬病病毒糖蛋白检测试剂盒对不同上样量和不同洗脱流速下的各洗脱峰进行检测。

2.2 冻干曲线优化试验

1)为达到理想的冷冻干燥效果，将无菌的狂犬病纯化抗原与耐热保护剂混合，测定混合液的共晶点与塌陷温度。本研究采用电阻法确定制品的共晶点，采用低温冻干显微镜测定塌陷温度，以控制冷冻干燥中预冻温度及升华过程主干燥温度。

2)疫苗冻干程序的设计。根据测定的共晶点温度和塌陷温度设计4条冻干程序如表1所示。

3)使用NIH(National Institutes of Health)法对冻干前后产品开展效力检测。

4)对冻干后产品进行物理性状检测、剩余水分检测、热稳定性试验。

表1 冻干程序

3 试验结果

3.1 纯化试验结果

1)不同上样量纯化效果比较，如表2所示。由表2可以看出，3个不同上样量纯化抗原的回收体积差别不显著。当上样量为600 mL时，A峰(ELISA检测为狂犬病毒峰)基本可降至基线，B峰ELISA检测狂犬病毒阴性，杂蛋白去除率在95%以上；上样量增加至960 mL时，A、B峰间的连线缩短，但基本可分开，杂蛋白去除率较5%柱床体积上样量降低了2%；而当上样量增至1 200 mL时，A峰中蛋白含量增高，B峰的前几管收集液经ELISA检测为病毒抗原阳性，杂蛋白去除率较5%和8%柱床体积上样量大幅度降低，只有79%左右。

2)不同洗脱流速纯化效果比较如表3所示。由表3可以看出，随着洗脱流速的增加，A、B峰间的连线越来越短，以128 mL/min洗脱时，无论是杂蛋白去除率还是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min。

表3 不同洗脱流速下纯化效果比较

综上所述，兼顾纯化效率及分离效果，确定Index Column 140/950层析柱层析分离浓缩狂犬病毒抗原的最佳上样量为960 mL(8%柱床体积)、最佳洗脱流速102 mL/min(线性流速40 cm/hr)。

3.2 冻干曲线优化试验

1)共晶点与塌陷温度的测定。对狂犬病纯化抗原与耐热保护剂混合液进行共晶点与塌陷温度的测定，共晶点温度为28.6 ℃，塌陷温度为24.9℃～22.3℃。

2)冻干前后效力检测结果，如表4所示。由表4各冻干程序冻干制品冻干前后效力检测结果可以看出，冻干程序3和冻干程序4的冻干效力损失基本相当，优于冻干程序2，由于冻干程序1在冻干过程中融化发泡，未进行效力检测。

表4 各冻干程序冻干制品冻干前后效力检测结果 单位：IU

3)冻干产品物理性状检测、真空度检测、剩余水分检测结果，如表5所示。由表5冻干制品物理性状、真空度、剩余水分检测结果可以看出，冻干程序3、冻干程序4的物理性状、要优于冻干程序1和冻干程序2，在剩余水分方面，冻干程序4的剩余水分偏高，整体来看，冻干程序3在所有冻干程序中是最优的。

表5 各冻干程序冻干制品物理性状、真空度、剩余水分检测结果

4)各冻干程序冻干制品热稳定性试验结果，如表6所示。由表6热稳定性试验结果可以看出，程序3冻干后制品热稳定性试验效力损失最小，且37℃ 10 d后制品的物理性状依然合格。程序4冻干后的制品热稳定性试验效力损失最大，且37℃ 10 d后制品的物理性发生严重萎缩现象，从本次热稳定性试验的结果可以推测，冻干制品的剩余水分对制品的保存影响很大。

表6 各冻干程序冻干制品热稳定性试验结果 单位：IU

4 讨论

本文研究的是不同上样量和洗脱流速对凝胶过滤纯化效果的影响。上样量过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，生产效率低[7]。洗脱速度也会影响凝胶过滤的分离效果，洗脱速度要恒定而且合适。一般来讲，洗脱速度慢一些，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但洗脱速度过慢又会造成样品扩散，加剧区带变宽，反而会降低分辨率，而且生产时间会大大延长，所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度[8]。通过试验显示，当上样量为5%～8%柱床体积时，病毒峰与杂蛋白峰可以完全分开，杂蛋白去除率在93%以上。洗脱流速是柱层析获得良好分离效果的另一重要条件，随着洗脱流速的增加，A、B峰间的连线越来越短，以128 mL/min洗脱时，无论是杂蛋白去除率还是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min，这是因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出。

真空冷冻干燥主要分为预冻、一次干燥和二次干燥。在冻干过程中要根据保护剂特性调整冻干程序，因此冻干工艺参数是调节冻干程序的重要依据之一，包括制品的固化温度和崩解温度[9]。预冻阶段，保证制品的温度低于共晶点温度，使得制品完全冻实，本次所有冻干曲线的预冻温度均设定为-42℃，保证了制品完全冻结；一次升华阶段，制品的温度要低于塌陷温度，防止制品出现局部或者整体塌陷的情况，当一次升华温度设定为-13℃和-18℃时，制品温度始终低于塌陷温度，制品外观光滑、疏松，但由于-18℃的设定温度偏低，冻干导致制品的残余水分增加，干燥效率降低，同时由于残余水分过大，导致热稳定性试验中制品出现了萎缩的现象，使得制品的效力大幅度下降。

5 结论

狂犬病灭活疫苗下游工艺，纯化时样品的上样量为8%柱床体积，洗脱流速为30～40 cm/hr的线性流速，最后纯化抗原加入冻干保护剂冷冻干燥，该生产工艺通过验证可以满足工业化生产，实现了狂犬病冻干灭活疫苗下游工艺规模化生产。