基于mtDNA探究部分地区密点麻蜥系统进化关系

韩 晨 张玉华 陈润润 李 铀，2 杨具田 陈伟基*

（1西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730100；2西北民族大学生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州 730030）

密点麻蜥（Eremias multiocellata）是我国北部和西北部荒漠草原和半荒漠草原最常见的一种卵胎生蜥蜴，在生态系统中处于消费者的位置，可保证能量遵循食物链和食物网逐级流动，在荒漠化草原生态系统中具有极其重要的作用。密点麻蜥的食性很广，捕食大量有害昆虫，对荒漠害虫的消灭与沙生植物的保护均具有重要意义[1]。在我国西北部，农场等人工基地越来越多，致使密点麻蜥栖息地数量急剧下降，严重影响其正常生理活动，现在密点麻蜥已被列为中国具有经济和科研价值的陆生动物之一[2]，且在2000年，密点麻蜥被录入《国家保护的有益的或有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》[3]。因此，对密点麻蜥进行群体系统发育分析，对后续密点麻蜥的保种工作以及资源合理利用具有重要意义。

动物线粒体DNA（mtDNA）具有分子量小、结构简单、母性遗传等特征，且基因重组发生率极低。基于这些特点，mtDNA可作为候选标志用于生物种群遗传变异、亲缘关系以及系统发育的研究，尤其适用于种下水平分类研究。编码蛋白质的ND4基因变异适中，含有准确的系统发育信息，是系统进化和种群遗传研究中的理想标记基因[4]；而NADH脱氢酶第二亚基基因（ND2）进化速率适中，能较好地反映出种内与群体间的遗传变化差异及系统分类地位，在鸟类、节肢动物、鱼类、爬行类、哺乳类等动物中被广泛用于系统发育和种群划分研究[5]。国内少有对密点麻蜥进行系统进化的研究，且未有研究者用ND2与ND4 2个基因对密点麻蜥进行系统进化分析。本研究基于线粒体ND2与ND4基因对宁夏与内蒙古两地的密点麻蜥进行系统进化分析，探讨其系统进化关系，以期为保种密点麻蜥、合理利用资源及维护我国西北部荒漠草原生态系统的生物多样性与生态平衡提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

在宁夏回族自治区与内蒙古自治区两地5个采集点共采集了20个密点麻蜥肌肉样本，采样地点见图1，样本信息见表1。

图1 采样地点

表1 样本信息

1.2 基因组DNA的提取

取少量保存于-20℃冰箱或95%乙醇中的肌肉组织，采用通用型基因组DNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）对其进行基因组DNA的提取。使用Qubit4对所提取的基因组DNA进行浓度检查。

1.3 PCR扩增

以GenBank中密点麻蜥mtDNA全序列为基础设计引物，由宝生物工程（大连）公司合成。利用引物对宁夏回族自治区、内蒙古自治区密点麻蜥进行线粒体ND2与ND4基因序列的扩增。本研究所用扩增ND2与ND4基因的引物有2对，引物序列见表2。

表2 密点麻蜥引物序列

PCR 扩增体系（25 μL）为上、下游引物各 0.5 μL，浓度为（10 mmol/L）；DNA 样品（50 ng/μL）2 μL，并添加 12.5 μL Premix Taq（Takara），浓度为 5 U/μL；补加9.5 μL无菌水。PCR反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性 45 s，55～60℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物进行1.4%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上检测。将检测合格的扩增产物送至兰州天启基因生物科技有限公司进行测序。

1.4 数据统计与分析

将获得的测序结果利用Geneious Prime 2021.1.1（https：//www.geneious.com）处理原始测序文件，将 2 条序列的波峰进行拼接得到较完整的序列波峰图，并对完整的样本序列波峰图进行校对，最终生成Fasta文件格式，获得单个样本的完整序列。所得密点麻蜥ND2、ND4基因序列与Genbank上已发表的国内其他麻蜥的ND2、ND4基因序列用MEGA-X[6]处理，所用信息见表3。利用MEGA-X将处理好的密点麻蜥ND2与ND4基因序列与在GenBank下载的7个国内其他麻蜥的部分序列，分别利用邻近法与最大似然法构建系统发生树。Genbank上已发表的国内其他麻蜥物种信息见表3。

表3 Genbank上已发表的国内其他麻蜥物种信息

选用p-disdtance作为模型且运用邻接法分别基于ND2与ND4基因构建系统进化树（图2），通过1 000次自展值检验计算支持率来保证系统树的可靠性。首先，运用MEGA-X软件中的MODELS功能，计算最大似然法构建系统发生树的最佳模型。其次，分析序列数据的BIC值（BIC值表示模型对数据的解释度，BIC值越小表示模型对数据的解释力越强），并选取BIC值最低的模型作为最佳模型。通过计算，基于ND2与ND4基因用最大似然法构建系统发生树的最佳模型分别为HKY+G+I与TN93HKY+G+I。最后，运用最大似然法构建ND2与ND4基因的系统发生树（图 3）。

图2 NJ系统发生树

图3 ML法构建系统发生树

2 结果与分析

2.1 ND2基因和ND4基因序列分析结果

将检测合格的PCR扩增产物送至兰州天启基因生物科技有限公司进行测序，测序结果显示扩增序列长度合适，为所扩增目标基因。序列经拼接比对后，获得一致序列：ND2基因长801 bp、ND4基因长1 123 bp。序列已输入美国生物信息中心（NCBI）的基因库（Genbank），ND2基因登录号为MZ516498-MZ516517，ND4基因登录号为MZ516477-MZ516496。应用MEGA-X软件中Statistic功能分析（仅针对20个密点麻蜥样本），ND2基因序列中碱基T、C、A和G平均含量分别为29.2%，30.5%，31.4%和8.9%。所有序列中变异位点共有70个，包括58个简约性信息位点、12个单变异性位点、10个转换以及2个颠换，转换数明显高于颠换数，其中C—T的转换发生频率高，颠换仅在A—G发生。ND4基因序列中碱基 T、C、A和 G的平均含量分别为 27.2%、33.3%、28.7%和10.8%。所有序列中变异位点共89个，包括79个简约性信息位点、10个单变异性位点、8个转换、2个颠换，其中A—G的转换发生频率高，A—T与C—A均发生颠换，C—G和T—G均未发生颠换。2个基因的A+T平均含量（60.6%、55.9%）均高于C+G平均含量（39.4%、44.1%），表现出较强的少G偏倚性，符合脊椎动物线粒体DNA序列特征[7]。

2.2 密点麻蜥基于ND2、ND4基因系统发育分析

基于ND2基因构建的NJ树与ML树不完全一致，在NJ树（图2）中，20个密点麻蜥样本分成2支，宁夏地区与内蒙古地区的样本各为1支且每个地区又各自分为2支。在宁夏地区，陶乐镇采集点的样本M60与沙坡头区采集点的样本M81聚为一支，说明两者间有较近的亲缘关系，且此支也与其他沙坡头区采集点的样本及1个陶乐镇采集点的样本M61聚为一支。陶乐镇采集点的样本M61与沙坡头区采集点的样本距离较远，但仍聚在同一支上。同是陶乐镇采集点的样本M59整体上与甘塘镇采集点所有样本聚为一支，说明样本间存在较近的亲缘关系。结果显示，陶乐镇与沙坡头区采集点以及陶乐镇与甘塘镇采集点的密点麻蜥样本间均具有亲缘关系，也说明陶乐镇与沙坡头区及与甘塘镇的样本间均可能存在基因流；内蒙古地区鄂尔多斯市鄂托克前旗采集点的2个样本（M92、M99）与二连浩特市采集点的2个样本（M195、M196）各自聚为一支，说明每个采集点中的2个样本间均具有较近的亲缘关系；其余7个其他麻蜥样本中，丽斑麻蜥与山地麻蜥各聚为一支，且与敏麻蜥、网纹麻蜥、荒漠麻蜥、快步麻蜥与虫纹麻蜥各分为6支，其中荒漠麻蜥与密点麻蜥虽然具有较远的样本距离，但整体仍聚在同一支上，可能由渗透杂交所致，其余6种麻蜥未与密点麻蜥聚在一支上，说明与密点麻蜥之间具有较远的亲缘关系，其中虫纹麻蜥最远。在ML树（图3）中，20个密点麻蜥样本与荒漠麻蜥、敏麻蜥、丽斑麻蜥、山地麻蜥、网纹麻蜥、快步麻蜥均聚为一支，且20个密点麻蜥样本间未见有其他分支，而虫纹麻蜥仍未与其聚为一支，与密点麻蜥样本亲缘关系最远。

基于ND4基因序列构建的NJ树与ML树所显示的各试验样本的位置和关系基本一致，且与ND2基因建立的NJ树大致相同。不同的是，基于ND4基因序列构建的NJ树显示，7个其他麻蜥样本中，快步麻蜥与虫纹麻蜥也聚为一支，说明2个物种间可能存在亲缘关系；而基于ND4基因序列构建的ML树与其NJ树相比，样本M80与M79等之间未见有明显分支。

3 讨论与结论

3.1 讨论

mtDNA由于其特有的优点而被广泛应用于分子变异种间或种内研究：①结构无组织特异性；②更易从材料中提取，母系遗传方式，便于进行群体分析，只需少量个体便能反映群体遗传结构；③进化速度快，一般为核基因组的5～10倍。常用的线粒体分子标记（包括蛋白编码基因，如 Cytb、ND2、ND4）进化速率较快，常表现出相对较大的变异，一般适合于亲缘关系较近的物种或种内遗传变异的研究[8]。蒋艳琳等[9]基于ND2基因对国内龙头鱼群体遗传多样性进行了分析，了解了其种间的遗传分化情况，揭示了我国龙头鱼种质资源现状，并为其保护提供了参考依据；魏 磊等[10]基于ND2和ND4基因合并序列探讨了豹属的分子系统关系，均验证了ND2、ND4基因在物种进化研究中的可行性。截至目前，尚未发现有关利用ND2与ND4基因共同探讨密点麻蜥系统进化关系的相关研究。

本研究经反复试验，选取PCR最优反应体系对来自2个地区的5个采样点的20个密点麻蜥样本mtDNA的ND2与ND4基因分别进行扩增。因为核苷酸序列数据属于性状数据，不能通过核苷酸序列来研究物种的进化距离，所以得到的扩增结果经测序及Geneious Prime 2021.1.1软件校对处理后需要用软件将核苷酸序列数据转化为种群个体之间的距离值，再进行分析[11]。

本次试验结果显示，密点麻蜥20个样本间整体聚为一支，根据采样地区不同又大致分为2个亚支，每个亚支间又因采集点不同再次产生分支。其中，陶乐镇与沙坡头区采集点的样本（M60与M81）以及陶乐镇与甘塘镇采集点（M59与M172等）的样本分别聚为同一支，具有较近的物种距离，说明其均具有亲缘关系，推断陶乐镇与沙坡头、陶乐镇与甘塘镇的样本间均可能存在基因流；从图 2（a）、图 3（a）、图3（b）等3个系统发育树可以看出，宁夏地区的16个密点麻蜥样本与内蒙古地区的4个密点麻蜥样本之间距离较远，具有较远的亲缘关系，可能因为地貌的特殊性和气候的差异性会对密点麻蜥种群的适应性造成压力，使得密点麻蜥适应各生境下的气候环境，进而在遗传上各种群产生了较高的分化程度[12]。同时，基于2个基因所建的4种不同的系统发育树可以看出，荒漠麻蜥与所采集的所有密点麻蜥样本整体上也聚为一支，说明二者间有可能也具有较近的亲缘关系，可能是密点麻蜥与荒漠麻蜥之间产生了渗透杂交，这与窦静莉[13]的研究相吻合。窦静莉[13]研究讨论了密点麻蜥和荒漠麻蜥形成渐渗杂交现象的原因，可能是人类活动使得密点麻蜥与荒漠麻蜥的生活环境发生改变，导致其中一个物种的数量发生改变，被迫选择与亲缘关系非常近且数量较丰富的物种进行交配，这便逐渐形成了杂交。

传统观点认为，物种内种群间的基因流可以维持物种自身的完整性，防止不同区域种群的适应性分化或遗传漂变引起种群产生遗传分化。但是，自然界中的小种群由于过度的基因交流，可能会产生近交衰退和遗传多样性的丧失，种群数量减少甚至趋于濒危。与物种内的基因流相比，不同物种种群间的基因流或杂交渐渗可以极大地丰富自然界生物多样化的程度，进一步促进物种形成[14]。

基于2个基因分别利用邻接法与最大似然构建的系统发育树的拓扑结构不完全一致，未完全解决采集样品的系统进化关系问题，这可能是由构建系统发育树的方法不同导致的。此外，所选基因长度的代表性有限和受谱系随机分选的影响，提供的系统发育信息不足以解析全面的系统关系也会导致拓扑结构的不一致[15]。

在今后的研究中，应尽可能利用更多试验手段，全方位且系统地揭示密点麻蜥种群遗传情况与系统进化关系，为其种质资源的有效保护和高效利用提供可靠参考。

3.2 结论

本研究结果显示，宁夏地区的3个采集点之间存在基因流，且所采集的全部密点麻蜥样本与国内荒漠麻蜥也存在着基因交流。对密点麻蜥种质资源的保护应避免密点麻蜥种群间的过度基因交流以及适当控制与近缘物种的渗透杂交，防止物种间差别缩小导致遗传同化，进而使得物种灭绝。