粉红螺旋聚孢霉与枯草芽胞杆菌共培养发酵滤液生防与促生活性

王亚楠，陈莹莹，范乐乐，马桂珍，李世东，孙漫红*，暴增海*

（1.江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，连云港 222000；2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100081）

土传病害是极为常见的植物病害，如丝核菌Rhizoctoniaspp.引起的立枯病、镰刀菌Fusariumspp.引起的枯萎病以及根结线虫Meloidogynespp.引起的线虫病等给农业生产造成巨大的损失[1,2]。当前，对这类病害的防控多采用土壤消毒、栽种抗病品种、生物防治、化学防治及轮作、水肥管理等农作措施[3,4]，其中化学防治应用最广。但由于存在污染环境、农药残留和产生抗药性等诸多问题，近年来化学农药的使用受到限制，而生物农药，尤其是生防微生物因环保安全、高效持效等特点在土传病害防治中发挥了越来越大的作用[5]。大量研究表明，在土壤中施用芽胞杆菌Bacillusspp.、假单胞菌Pseudomonasspp.和木霉Trichodermaspp.等有益细菌和真菌或生防菌代谢产物可有效降低土传病害的发生与危害，促进植物生长、提高产量[6-7]。但由于土壤环境复杂，生防微生物应用时会受到多种因素的影响，导致防效不稳定，因此提高生防产品防病作用和稳定性极为重要。

为了提高生防菌防病效果，解决多种病原物复合侵染等问题，实际生产中有时会将不同的生防菌混合使用[8,9]。魏滟洁等[10]发现，球毛壳菌Chaetomiumglobosum与枯草芽胞杆菌B.subtilis混合使用后对黄瓜枯萎病的防效显著高于单一菌株的防效。Keyser等[11]将棕色绿僵菌Metarhiziumbrunneum与粉红螺旋聚孢霉Clonostachysrosea孢子悬液混合后处理小麦种子，可有效防治由黄色镰孢菌F.culmorum和黄粉虫Tenebriomolitor引起的种传病害和虫害。将多种有益菌联合使用，利用不同生防微生物的不同作用机制，实现优势互补，以充分发挥生防作用，对提高防病水平具有重要的意义。

共培养技术作为多种微生物组合使用的一种方法，可提高有效代谢组分的产量，并诱导生成新化合物[12]。当前，对生防微生物共培养技术的研究主要集中在生防菌组合及培养条件筛选，以提高发酵水平和生防效果。Li等[13]通过正交试验优化深绿木霉T.atroviride与枯草芽胞杆菌共培养条件，大幅提高了抗真菌次级代谢产物产量，进而提高了对禾谷镰刀菌F.graminearum的抑制作用。Emanuel等[14]发现木霉与枯草芽胞杆菌共培养可诱导产生乙酸丁酯，提高对鳄梨炭疽病的防效，而乙酸丁酯是抑制胶孢炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides生长的一个重要因子。但目前有关利用不同生防菌共培养防治各类土传病害及对植物生长的影响研究还较少。

粉红螺旋聚孢霉是一类重要的生防真菌，可通过重寄生、拮抗和竞争等多种作用机制防治植物病害[15,16]。Anwar等[17]发现粉红螺旋聚孢霉能够在番茄叶片上快速定殖并大量产孢，从而抑制灰霉病菌的繁殖，控制灰霉病的发生。粉红螺旋聚孢霉也可以通过分泌丝氨酸蛋白酶降解线虫体壁，并利用降解产物提供自身营养，从而防治线虫的为害[18]，此外，这类生防菌还可以产生植物生长素类的代谢物，促进种子萌发和植株生长，减少衰老[19,20]。迄今，粉红螺旋聚孢霉已在温室、大田广泛应用，对纹枯病、枯萎病、线虫病等多种植物病害显示出良好的生防效果[21-23]，但其应用中有时也会出现防治效果不理想、不稳定的问题。

粉红螺旋聚孢霉67-1是本实验室分离筛选到的一株高效粉红螺旋聚孢霉生防菌株[24]。前期研究发现，将67-1与生防芽胞杆菌共培养可提高产孢量、缩短发酵周期，本研究在此基础上测定了共培养发酵滤液对不同病原菌的抑菌活性，杀线虫活性和促生作用，以期为提高生防菌作用效果、研发高效生防新产品提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与线虫

粉红螺旋聚孢霉Clonostachysrosea67-1分离自海南省乐东县菜园土壤，枯草芽胞杆菌B006分离自黑龙江省大豆田。大豆菌核病菌Rhizoctoniasolani分离自黑龙江省大豆病株，甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans和西瓜枯萎病菌F.oxysporumf.sp.niveum分离自河北廊坊蔬菜大棚病株。以上菌株均由中国农业科学院植物保护研究所土传病害组保存。

根结线虫采自内蒙古赤峰市红山区文中镇黑沟门村设施大棚感病番茄根部。

1.2 供试黄瓜

中农106号，购买于北京中蔬种业公司。

1.3 培养基

玉米粉/豆粕粉培养基：玉米粉16 g，豆粕粉6.8 g，MgSO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，水1 L。

葡萄糖/硫酸铵培养基：葡萄糖 30 g，(NH4)2SO41.5 g，MgSO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，水1 L。

NB培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，水1 L。

PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L。

各培养基装液量100/500 mL三角瓶，121 ℃湿热灭菌25 min。

1.4 发酵滤液的制备

菌株67-1在PDA培养基上26 ℃培养7 d，刮取菌丝和孢子接种于PDB培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，制备菌株67-1种子液，浓度为108孢子/mL。菌株B006在NB培养基中28 ℃、180 r/min培养20 h，制备浓度为109孢子/mL的种子液。将菌株67-1种子液分别接种于玉米粉/豆粕粉、葡萄糖/硫酸铵培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养24 h后接种枯草芽胞杆菌B006种子液，继续培养24 h。以在2种培养液中分别接种菌株67-1和菌株B006为对照。将发酵液4 ℃，10000 r/min离心20 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜去除菌体，制备共培养发酵滤液。

1.5 发酵滤液抑菌活性测定

将发酵滤液与冷却至55 ℃左右的PDA培养基按1:4（v / v）比例混合，倒入9 cm培养皿中。用打孔器将PDA平板上培养7 d的大豆菌核病菌、甘蓝枯萎病菌和西瓜枯萎病菌打成直径为0.5 cm的菌饼，接种于培养基中心，28 ℃下培养7 d。十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，同时刮取菌丝，测定生物量。抑菌率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。以未添加发酵滤液的PDA为对照。每个处理3个重复。

1.6 发酵滤液杀线虫活性测定

取根结线虫发病严重的番茄根，切成1～2 cm的小段，放入1%次氯酸钠溶液中，用玻璃棒搅动3～4 min，快速倒入200目网筛中，500目网筛收集流出液。自来水反复冲洗，将收集的根结线虫卵转移至含有少量无菌水的培养皿中，25 ℃恒温培养箱中孵化24 h，收集2龄幼虫，制备线虫悬液，调节浓度约为300 J2/mL。

取3 mL共培养发酵滤液和1 mL线虫悬液加入6孔组织培养板中，混匀后于25 ℃培养箱中静置24 h。加入4 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液，摇匀后迅速于40倍倒置显微镜（OLYMPAUS CK2）下计数，记录死亡线虫数及线虫总数，以单一菌株发酵滤液和清水为对照。活跃，弯曲蠕动的幼虫为活线虫；虫体僵直呈直线状，且加入NaOH溶液后仍然僵直不动的为死亡线虫。计算线虫死亡率，校正死亡率（%）＝（处理死亡率－对照死亡率）/（1－对照死亡率）×100。每个处理3个重复。

1.7 发酵滤液对黄瓜种子萌发的影响

选取籽粒饱满的黄瓜种子，用0.5%次氯酸钠溶液消毒2 min，无菌水冲洗3遍，晾干。在15 cm玻璃培养皿中放置同等大小的灭菌滤纸，加入4 mL稀释5倍的共培养发酵滤液。将黄瓜种子置于滤纸上，每皿15粒，26 ℃培养箱中培养，每天补充无菌水保持滤纸湿润。以稀释5倍的单一菌株发酵滤液和清水为对照。每天统计种子发芽数，4 d时测定幼苗长度，计算活力指数。每个处理3个重复。

1.8 发酵滤液对黄瓜幼苗的促生作用

将消毒的黄瓜种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，28 ℃培养箱中避光催芽24 h。待种子露白后温室播种，每盆3株。待黄瓜幼苗长出真叶后取稀释1倍的发酵滤液灌根，每株5 mL。每隔7 d灌根1次，连续灌根4次。待28 d处理结束后，测定幼苗株高、茎粗、叶面积，以及幼苗地上部与地下部鲜重。以单一菌株发酵滤液和清水为对照。每个处理12盆，3个重复。

1.9 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2011和SPSS 24软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 共培养发酵滤液对病原菌的抑制作用

2.1.1 发酵滤液对大豆菌核病菌菌核形成的影响 立枯丝核菌在玉米粉/豆粕粉培养基和葡萄糖/硫酸铵培养基中培养7 d后会形成大量的菌核，而菌株67-1和B006发酵滤液处理后均可显著减少立枯丝核菌菌核的数量，且共培养发酵滤液处理后菌核数量明显少于单一菌株发酵滤液。在玉米粉/豆粕粉培养基中共培养发酵滤液处理后几乎没有菌核产生（图1）。

图1 生防菌发酵滤液对大豆菌核病菌菌核形成的抑制作用Fig.1 Inhibition of sclerotial formation in R.solani of soybean by the fermentation filtrates of biocontrol agents

2.1.2 发酵滤液对甘蓝枯萎病菌和西瓜枯萎病菌生长的影响 菌株67-1和菌株B006发酵滤液对2种枯萎病菌均有一定的拮抗作用，且2种培养基中共培养发酵滤液对病原菌菌落扩展和生物量积累的抑制作用显著高于单一菌株发酵滤液（P＜0.05）。当培养基中含有葡萄糖和硫酸铵时，其代谢物拮抗作用更为明显，其中对甘蓝枯萎病菌的抑制率比菌株67-1和菌株B006发酵滤液分别提高了86.6%和62.7%，病原菌生物量减少 36.2%和 19.7%（图 2）。共培养发酵液处理后西瓜枯萎病菌菌丝扩展速度较粉红螺旋聚孢霉滤液处理显著降低，菌落直径虽然与芽胞杆菌处理没有差异，但菌丝稀疏，生物量显著下降，在玉米粉/豆粕粉和葡萄糖/硫酸铵培养中分别减少了20.8%和11.3%（图3）。

图2 生防菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌生长的影响Fig.2 Effects of the fermentation filtrates of the biocontrol agents on growth of F.oxysporum f.sp.conglutinans

2.2 共培养发酵滤液对根结线虫二龄幼虫杀虫能力

粉红螺旋聚孢霉滤液处理24 h后根结线虫2龄幼虫的致死率近50%，共培养发酵滤液处理后杀虫效果显著提高。但不同培养基中代谢物杀线虫活性存在一定的差异，以葡萄糖/硫酸铵为培养基共培养发酵滤液的杀线活性更强，提高了50.8%，玉米粉/豆粕粉培养基中的共培养发酵滤液的杀线活性提高了37.0%（图4）。

图4 生防菌发酵滤液对根结线虫的校正致死率Fig.4 The correction fatality rate of biocontrol agents fermentation filtrates to juveniles of root-knot nematode

2.3 共培养发酵滤液对黄瓜种子萌发和黄瓜幼苗生长的影响

2.3.1 生防菌发酵滤液对黄瓜种子萌发的影响 粉红螺旋聚孢霉和芽胞杆菌发酵滤液处理后黄瓜种子活力指数、苗重及芽长显著增加，且生防菌共培养滤液对芽长的增加、活力指数的提升显著高于单一菌株发酵液（P＜0.05），2种共培养发酵滤液浸种后黄瓜种子的活力指数提高了19.6%～24.5%（表1）。

表1 生防菌发酵滤液对黄瓜种子萌发的影响Table 1 Effect of fermentation filtrates on the germination of cucumber seeds

2.3.2 生防菌发酵滤液对黄瓜幼苗的促生作用 不同发酵滤液处理后黄瓜茎粗、株高、地上部显著提高，其中共培养滤液对幼苗株高、地上和地下部鲜重的提高显著，优于单一生防菌发酵滤液（P＜0.05）。不同培养条件下代谢物的活性也存在一定的差异，以玉米粉/豆粕粉为碳氮源时，共培养发酵滤液处理的黄瓜地上部鲜重比葡萄糖/硫酸铵培养基提高了20%（表2）。

表2 生防菌发酵滤液对黄瓜幼苗的促生作用Table 2 Growth promoting effect of fermentation filtrates on cucumber seedlings

3 讨论

本文通过对粉红螺旋聚孢霉和枯草芽胞杆菌共培养发酵滤液的生物学活性测定发现，共培养发酵滤液可以提高生防菌抗真菌活性、杀线活性、促进植物种子萌发和生长，这可能是共培养过程中2种生防菌共同作用的结果。在共培养过程中，不同类型的生防菌由于彼此间的竞争诱导分泌了更多的抗菌物质，且这些代谢产物也会对彼此的生长和代谢产生影响。研究发现，枯草芽胞杆菌可以诱导侧孢短芽胞杆菌Brevibacilluslaterosporus产生新的抗菌物质，从而提高抗植物病原真菌的活性[25]；苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis可以刺激枯草芽胞杆菌产生更多的脂肽类化合物，从而提高抑菌效果[26]。粉红螺旋聚孢霉和枯草芽胞杆菌在共同发酵培养过程中生防菌代谢物的变化可能是导致共培养发酵滤液生防活性增强的一个重要原因。其次，共培养过程中不同的生防菌相互作用，也会对彼此的生长、产孢产生影响。Li等[27]发现枯草芽胞杆菌分泌的脂肽类抗生素可以诱导木霉厚垣孢子的产生，Valliappan等[28]发现木霉菌与解淀粉芽胞杆菌共培养过程中其产孢和生长相关的酶基因表达水平显著提高。我们在前期研究中也发现，将粉红螺旋聚孢霉与芽胞杆菌共培养能够显著提高真菌产孢和生长（待发表）。由于生物量的增加，提高了生防真菌活性代谢组分的含量，进而共培养发酵滤液生防作用增强。粉红螺旋聚孢霉可产生多种具有杀线虫活性的代谢物和细胞壁降解酶，而枯草芽胞杆菌可分泌大量脂肽类抗生素等抑菌活性物质，将粉红螺旋聚孢霉与芽胞杆菌组合，通过不同生防菌株的优势和功能互补，充分发挥二者的作用，从而有效提高对植物土传病害的防控作用，促进作物健康生长。

不同营养条件对生防真菌和细菌共培养发酵液生物活性的影响不同。对营养物质的利用直接影响了生防菌的生理代谢和生长繁殖，进而影响生防菌生防作用的发挥[29,30]。本试验中我们分别采用了营养丰富的玉米粉和豆粕粉，以及速效碳氮源葡萄糖和硫酸铵，结果发现葡萄糖/硫酸铵培养基中共培养发酵液的生防活性更高。这可能是共培养过程中，速效营养成分更有利于生防菌的摄取利用，其生长代谢速率更快，活性物质产量更高，从而表现出更强的生物活性。张燕等[31]发现不同碳源可影响荧光假单胞菌P.fluorescens抗生素2,4-DAPG相关基因的表达，进而影响抗生素的合成，当葡萄糖为碳源时2,4-DAPG产量最高，对棉花立枯丝核菌抑制作用最强。Meyer和Stahl[32]通过调整巨大曲霉Aspergillusgiganteus与尖孢镰刀菌共培养的碳氮源，发现共培养过程中巨大曲霉中抗真菌蛋白基因表达量的变化很大程度上取决于培养基的组成。本实验中，生防菌更易于利用速效营养生长繁殖，真菌-细菌间的相互作用表现得更为显著。

通过将粉红螺旋聚孢霉与枯草芽胞杆菌共同发酵培养，提高了生防菌对病原真菌、根结线虫的生防作用以及黄瓜种子萌发、生长的促进作用。后续将进一步开展温室评价，并探讨其作用机制，为高效生防新产品的研发和应用奠定基础。