海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用

郝大志，王咏坤，陈 捷*，辛舟生，高永东

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.山东洁晶集团股份有限公司，日照 276826；3.上海市农业技术推广服务中心，上海 201100）

国内外对于海藻渣的综合利用已有大量的研究[1-3]。海藻渣含粗蛋白约 20%，粗纤维约 50%，灰分约3%，此外还富含水杨酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素等10余种生物刺激素及超氧化物歧化酶等[4-6]，因此海藻渣所制备有机肥可以提高植物的光合作用、抗逆能力及耐盐碱性，从而提高作物产量和品质[7-11]。木霉及芽胞杆菌是常见的植物促生菌及植物土传病害生物防治微生物，主要通过拮抗、竞争、重寄生和诱导抗性等机制来保护植物免受病原菌侵袭[12,13]。在黄瓜枯萎病防治方面，季倩茹等[14]研究表明，巨大芽胞杆菌B213、多粘类芽胞杆菌B207和枯草芽胞杆菌B204三菌联合对黄瓜枯萎病的防治及防御反应酶系的诱导有明显协同增效作用。朱森林等[15]创制的深绿木霉水分散粒剂的防效超过化学药剂，叶片抗性氧化酶活性、叶绿素和脯氨酸含量明显增加。廉华等[16]研究表明，木霉菌分生孢子和厚垣孢子均能增加黄瓜幼苗叶片过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbic acid peroxidase，APX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，提高对黄瓜枯萎病的防治效果。尽管木霉菌与芽胞杆菌的组合使用在防治植物土传病害方面具有明显的协同增效作用[17-19]，但关于海藻渣与木霉+芽胞杆菌复合菌剂在防治病害中的协同增效作用研究并不多见。苏东海等[20]用枯草芽胞杆菌、乳酸菌、酵母菌等混合菌株对海藻渣进行发酵，其粗纤维含量大幅提高。赵忠祥等[21]利用绿色木霉固体发酵海带渣，发酵过程中纤维素被显著分解，还原糖含量提高。说明了海藻渣可以被木霉菌、芽胞杆菌分解利用。目前大部分的微生物菌剂主要选用硅藻土、高岭土等惰性物质为营养和孢子载体，而海藻渣则可作为很好的菌剂营养载体及促生物质来源。周莹等[22]制备了以海藻渣为载体的枯草芽胞杆菌菌剂，有效防治了丹参根腐病。但海藻渣与木霉菌的复配使用未有报道。实验室前期研究已经证实了海藻渣复配木霉菌剂、芽胞杆菌菌剂对黄瓜幼苗促生作用的协同增效，因此研究海藻渣与木霉和芽胞杆菌复合菌剂间在防治黄瓜苗期枯萎病中的协同作用机制，对高效利用海藻渣，开发添加海藻渣的新型复合生物农药或生防菌剂具有重要意义。

本研究将棘孢木霉Trichodermaasperellum、解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens与海藻渣制备成复合制剂，通过与单一海藻渣制剂、单一混合菌制剂比较，明确三者防治黄瓜枯萎病、促进幼苗生长的协同增效作用，为海藻渣资源化利用探索一条新途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试作物 黄瓜（申青一号），购买于上海富农种业有限公司。

1.1.2 供试海藻渣（平均粒径0.25 mm）由山东结晶集团股份有限公司提供。

1.1.3 供试菌剂 棘孢木霉TrichodermaasperellumGDFS1009菌剂（2亿 cfu/g，载体硅藻土）由本实验室提供；解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensFS1841菌剂（2000亿 cfu/g，载体麦芽糊精）由四川龙蟒福生科技有限公司提供。

1.1.4 供试病原菌 黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum由本实验室提供。

1.1.5 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（potato pextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。马铃薯葡萄糖液体培养基（potato pextrose，PD）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。

1.1.6 供试栽培基质与土壤 蔬菜栽培有机基质（有机质含量55.2%）购买于丹阳市茂禾有机肥料有限公司。自然田土（有机质含量2.76%）；自然田土壤过1 mm筛后与有机基质1:1混合，121 ℃高温蒸汽灭菌1 h。

1.1.7 供试化学试剂 水杨酸（Sigma-Aldrich，CAS No.69-72-7），茉莉酸（Sigma-Aldrich，CAS No.77026-92-7）。多酚氧化酶（PPO）检测试剂盒（雷根生物技术有限公司，Cat：TE0427）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（雷根生物技术有限公司，Cat：TE0720）、过氧化物酶（POD）检测试剂盒（雷根生物技术有限公司，Cat：TE0423）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（雷根生物技术有限公司，Cat：TE0740）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）检测试剂盒（雷根生物技术有限公司，Cat：TE0401）。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌孢子悬浮液的制备 将黄瓜枯萎病病原菌在 PDA 培养基上 28 ℃活化培养3 d，转接到 PD培养基上，28 ℃、200 r/min培养5 d，发酵液经8层纱布过滤后获得孢子悬浮液。用血细胞计数器检测孢子悬液的孢子数，并将孢子悬浮液稀释至1×106cfu/ mL。

1.2.2 盆栽处理与方法 将海藻渣、木霉菌剂、芽胞杆菌菌剂、载体分别按照不同处理与土壤混匀，使得土壤中的海藻渣含量为1%、木霉含量为3.0×105cfu/g、芽胞杆菌含量为2.0×108cfu/g。共4个处理：海藻渣+木霉菌剂+芽胞杆菌菌剂（T1）、海藻渣（T2）、木霉菌剂+芽胞杆菌菌剂（T3）和空白载体处理（CK）。上述制剂与土壤均匀混合，每个处理播种3个育苗盘，随机区组设计。

处理方法：将不同处理的土壤装入21孔塑料育苗盘（34.5 cm×24 cm×11 cm）中，每孔栽入催芽黄瓜种子2粒。播种后充分浇水，直至穴盘底部排水孔有水溢出。在人工气候室内培育，育苗光照时间为16 h光照/8 h黑暗，室内温度控制24 ℃～25 ℃，每3 d浇施1000 mL无菌水。3 d后每穴只保留一棵苗生长。

病菌接种与取样: 栽种15 d后灌根接种黄瓜枯萎病菌1×106cfu/mL，每穴5 mL。分别于接种病菌0、3、6和9 d后取黄瓜第二片真叶与主根系，用锡箔纸包好。在接种病原菌当天取主根表面土壤，放入黑色离心管，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后续试验测定。

1.3 黄瓜根系防御反应物质测定

1.3.1 水杨酸和茉莉酸的提取 称取0.1 g黄瓜（二叶期幼苗）根系与第二片真叶，液氮中研磨至粉碎。向粉末中加入1 mL提取缓冲液（甲醇:水:甲酸＝70:29:1），4 ℃振震荡30 min后于4 ℃、13000 r/min离心20 min，取上清液。再经离心浓缩仪浓缩6 h，残渣用200 μL甲醇溶解，获得茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）粗提样，保存于棕色瓶。

1.3.2 标准曲线绘制 将水杨酸、茉莉酸标品配置成0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/mL的混合标品，制备标准曲线，根据峰面积与浓度的线性关系y＝1.1e＋003x＋4.65e＋004（r＝0.9995）计算水杨酸浓度，y＝2.54e＋003x＋1.17e＋003（r＝0.9995）计算茉莉酸浓度。

1.3.3 茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水杨酸（salicylic acid，SA）LC-MS/MS分析 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（Nexera LC30AD&SCIEX SelexION Triple Quad 5500 System），日本岛津公司& Sciex公司。

色谱条件：色谱柱为ACQUITY BEH C18液相柱 2.1 mm×100 mm×1.7 μm；进样量为5 μL；流动相为0.1%（质量分数）甲酸水溶液（A相）和甲酸乙腈（B相）；柱温为40 ℃。

质谱条件：ESI负离子模式；气帘气：35 psi；离子化电压：-4500 V；去溶剂温度：500 ℃；雾化气：55 psi；辅助加热气：55 psi；多重反应监测（multiple reaction ,monitoring，MRM）分析。

1.3.4 茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量计算 C样＝（A样×C标×V标）/（A标×V样）。其中，A：峰面积；C：浓度；V：体积；标：JA/SA标样；样：待测样品。单位鲜重样品JA/SA含量（ng/g）＝（C样×定容体积）/样品鲜重。

1.4 黄瓜叶片抗氧化酶系活性测定

叶片酶活测定方法：多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammo-nialyase，PAL）活性测定方法参照试剂盒说明书，PPO活性单位为每1 min吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位（U），SOD活性单位以抑制氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）光化还原的50%为一个酶活性单位（U），POD活性单位为每1 min吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位（U），CAT活性单位为在37 ℃、1 min催化水解1 μmoL过氧化氢量为一个CAT酶活力单位（U），PAL活性单位为每1 h吸光度变化0.01所需酶量为一个酶活性单位（U）。

1.5 黄瓜叶片防御反应相关基因表达分析

RNA提取与cDNA反转录合成：按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，使用NanoDrop超微量分光光度计检测其纯度和浓度后，保存于-80 ℃。以总RNA为反转录模板，按照试剂盒说明书进行基因组DNA去除与反转录。16 μL基因组DNA去除体系：50 ng/μL终浓度模板、4×g DNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O补足至16 μL，42 ℃反应2 min。20 μL反转录体系：16 μL去除基因组DNA模板、5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL。PCR反应程序：37 ℃孵育15 min；85 ℃加热失活5 s。将反转录获得cDNA于-20℃保存备用。

实时荧光定量PCR分析：20 μL反应体系：50 ng/μL cDNA 2.0 μL、10 μmol/L正反向引物（表1）各0.4 μL、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Super Mix 10.0 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序：95 ℃预变性300 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环；95 ℃熔解10 s，65 ℃熔解60 s，97 ℃熔解1 s；37 ℃冷却30 s，以EF1-α为内参，设3个生物学重复。反应结束后，观察熔解曲线趋势是否正确，根据实时荧光定量PCR仪检测到的CT值，按照2-ΔΔCT法，计算不同处理时间下黄瓜叶片中目的基因的相对表达量。

1.6 黄瓜苗期枯萎病防效

病原菌接种9 d后统计黄瓜苗期枯萎病病情指数。黄瓜苗期枯萎病的分级标准参照方中达[23]的分级标准，0级：无症状；1级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50%；2级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50%；3级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；4级：全株严重萎蔫，以致枯死。病情指数参照宗兆锋和康振生[24]的计算方法，病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.7 相关性分析

将海藻渣+木霉菌剂+芽胞杆菌菌剂（T1）与木霉菌剂+芽胞杆菌菌剂（T3）所测的各项酶活、SA含量、JA含量、基因相对表达量进行相关性分析，相关系数越接近1说明T1与T3在该项为协同增效。

1.8 数据统计与分析

利用GraphPad Prism 9.0软件进行图表制作，数据采用SAS 9.4软件通过最小显著差异法（LSD）比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂防治黄瓜苗期枯萎病

海藻渣+木霉+芽胞杆菌混合菌剂（T1）、海藻渣单独使用（T2）、木霉＋芽胞杆菌混合菌剂（T3）与CK间病情指数出现显著差异，T1、T2、T3处理病情指数极显著低于CK处理，海藻渣＋木霉＋芽胞杆菌混合菌剂（T1）的防治效果显著高于海藻渣单独使用（T2）及木霉+芽胞杆菌混合菌剂单独使用（T3）。木霉+芽胞杆菌混合菌剂（T3）的防治效果显著高于海藻渣单独使用（T2）；海藻渣单独使用（T2）的防治效果较差，平均防效只有25.79%，证明海藻渣本身诱导黄瓜幼苗对枯萎病是有限的；木霉＋芽胞杆菌混合菌剂（T3）平均防效为81.78%，添加海藻渣后防效提高到93.49%，提高了11.71%，结果表明海藻渣可以增强木霉菌剂、芽胞杆菌菌剂对黄瓜幼苗枯萎病防效，海藻渣与木霉菌剂、芽胞杆菌菌剂对黄瓜幼苗枯萎病防效协同增效（表2，图1）。

图1 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的影响Fig.1 Influence of seaweed residue on the control effect of Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents gainst cucumber Fusarium wilt

表2 海藻渣复配微生物菌剂处理对黄瓜枯萎病防效的影响Table 2 Effect of seaweed residue combined with microbial agents on cucumber Fusarium wilt

2.2 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响

通过灌根接种尖孢镰刀菌后0、3、6和9 d测定叶片抗氧化酶系的活性结果表明，叶片超氧化物歧化酶（SOD）与苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化趋势相近。与 CK相比，未接种病原菌情况下的 T1、T2和T3处理的叶片SOD活性及PAL活性均显著高于CK；随着接种病菌后时间的增加，各处理的植物防御反应逐渐加强，其中T1处理的大部分时间节点中的叶片SOD活性、PAL活性均高于T3和T2处理，可见海藻渣能增强木霉＋芽胞杆菌混合菌剂对叶片SOD和PAL活性的诱导（图2）。

随着接种病菌后时间增加，T1、T3的POD、CAT活性均显著提高，PPO变化较为复杂。但在9 d时，T1的POD、PPO、CAT活性为所有处理中最高，且T1＞T3＞T2（图2）。

综上试验结果，由于抗氧化酶系统变化较为复杂，在病原菌刚接种时不同处理中POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性变化并不一致，但T1处理的黄瓜叶片POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性均随着接种病原菌后的天数增加而提高，T1处理叶片的酶活在9 d时均高于T2、T3及CK。海藻渣对黄瓜抗氧化系统酶活有一定的诱导作用，添加海藻渣可以进一步增强微生物菌剂的诱导效果，海藻渣与木霉+芽胞杆菌混合菌剂在诱导黄瓜抗氧化酶系统中表现为协同增效（图2）。

图2 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of seaweed residue on antioxidant enzyme activity of cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.3 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜根部和叶片水杨酸和茉莉酸含量变化的影响

在未接种病菌情况下，海藻渣及微生物菌剂对黄瓜根系茉莉酸积累有显著影响，T1处理中茉莉酸含量是CK的0.46倍，T2、T3处理的茉莉酸含量则低于CK。接种后6 d，T1、T2、T3处理的茉莉酸含量仍呈降低趋势，但水杨酸含量则逐渐增加，推测可能与茉莉酸信号通路途径和水杨酸信号通路途径间存在拮抗关系有关（图3A）。

图3 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗根系茉莉酸（A）、水杨酸（B）含量变化的影响Fig.3 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid (JA ) and salicylic acid (SA) content in cucumber seedling roots induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

在未接种病菌的情况下，海藻渣及海藻渣＋木霉＋芽胞杆菌混合菌剂对黄瓜根系水杨酸含量无显著影响，但在接种病原菌后则显著提高黄瓜根系积累水杨酸的速度。在接种病原菌3 d后，T1中水杨酸含量为CK的0.5倍，而T2、T3水杨酸含量无显著变化；在接种病原菌6 d后，T2水杨酸迅速上升至CK的0.75倍，且比T1及T3还要高；在接种病原菌9 d后，T1水杨酸为CK的0.77倍，为所有处理中最高，T3高于T2。T2在9 d时水杨酸含量降低，这可能是因为单独的海藻渣处理对黄瓜防御反应的诱导不具有持效性。与T2相比，T1具有对寄主防御反应更为持效的诱导能力，说明海藻渣能强化微生物菌剂的诱导效应（图3B）。

未接种病菌的情况下，海藻渣及混合菌剂对黄瓜叶片水杨酸积累有一定影响，但不显著。接种病菌后，CK、T1、T2、T3叶片中水杨酸含量均逐渐增加，且呈T1＞T3＞T2＞CK，说明了海藻渣与微生物菌剂诱导叶片中水杨酸积累具有协同作用。接种后叶片中的茉莉酸积累也有类似规律（图4A、B）。

图4 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片茉莉酸、水杨酸含量变化的影响Fig.4 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid (JA ) and salicylic acid (SA) content in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

综上检测结果，无论在根系还是叶片中水杨酸含量都显著高于茉莉酸含量，说明海藻渣及混合菌剂主要诱导黄瓜的水杨酸含量增加，以激发相关防御反应途径。叶片及根系中水杨酸含量均为 T1＞T3＞T2＞CK，说明了海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片及根系中水杨酸积累具有显著增效作用。在未接种病原时，各处理间的根系及叶片中水杨酸含量差异较小，而茉莉酸差异较大，说明在未接种病原菌时，海藻渣及微生物菌剂就已经提高茉莉酸含量，以提高黄瓜幼苗的抗病性；而在接种病原后，水杨酸含量快速增加，主要通过提高水杨酸的应答速度及含量来提高黄瓜幼苗的抗病性。海藻渣对水杨酸含量增加的诱导能力虽然低于微生物菌剂，但海藻渣对茉莉酸含量增加的诱导能力强于微生物菌剂，海藻渣的添加丰富了微生物菌剂的系统诱导抗性（图3，4）。

2.4 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜叶片防御反应信号相关基因表达的影响

2.4.1 对水杨酸SA途径的影响 测定接种病菌0、3、6和9 d的黄瓜幼苗叶片水杨酸相关基因的表达情况，发现海藻渣及混合菌剂处理均可以激活黄瓜幼苗防御反应。未接种病原菌时，海藻渣及混合菌剂处理黄瓜根部可引起黄瓜叶片内与水杨酸相关的基因PAD4、PR1、NPR1的表达变化，T1处理显著上调。接种病原菌后CK的PAD4、PR1表达上调，NPR1表达下调，但变化程度较小；T1的PAD4、PR1、NPR1表达显著上调；T2的PAD4、PR1表达上调，NPR1表达下调；T3的PAD4、PR1、NPR1表达显著上调，但上调程度低于T1。与CK相比，海藻渣及混合菌剂处理的叶片无论是否接种原菌，PAD4、PR1、NPR1均被诱导表达上调，且T1上调程度显著高于T3，T3显著高于T2。与黄瓜叶片水杨酸含量变化相比，SA途径基因表达先于含量变化，且诱导效应逐渐衰减，但水杨酸含量逐步增加。海藻渣本身对黄瓜幼苗防御反应具有一定的诱导能力，但不如微生物菌剂，添加海藻渣增强了木霉+芽胞杆菌混合菌剂对防御反应诱导能力，SA途径基因表达水平提高，水杨酸含量积累，表明了海藻渣与木霉+芽胞杆菌混合菌剂对黄瓜幼苗枯萎病防效的协同作用（图5）。

图5 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片水杨酸途径基因表达的影响Fig.5 Effect of seaweed residue on the relative expression level of salicylic acid pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.4.2 对茉莉酸JA途径的影响 关于茉莉酸途径的诱导，未接种病原菌时，T1处理LOX1显著上调、LOX2显著下调，T2、T3处理LOX1、LOX2均显著上调。接种病菌后CK的LOX1表达下调，LOX2表达先上调后下调；T1的LOX1表达上调，LOX2先下调，在6 d后上调；T2的LOX1、LOX2均表达下调；T3的LOX1表达下调，LOX2先上调，6 d后下调。与CK相比，海藻渣与混合菌剂处理在LOX2基因表达水平表现协同增效，但在LOX1基因上未表现；LOX1基因表达水平更多受海藻渣的影响，LOX2基因表达水平更多受微生物菌剂影响。0～6 d内基因表达水平变化趋势与叶片JA含量相吻合。在未接种病原菌，海藻渣本身对黄瓜幼苗JA途径强于微生物菌剂，接种病原菌后，LOX1与LOX2在3和6 d时表达水平表现出相反的变化，但在9 d时，T1的LOX1显著高于T2、T3，T1的LOX2显著高于T3，表明添加海藻渣增强了木霉+芽胞杆菌混合菌剂对JA途径的诱导能力（图6）。

图6 海藻渣对木霉+芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片茉莉酸途径基因表达的影响Fig.6 Effect of seaweed residue on the relative expression level of jasmonic acid pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.4.3 对乙烯途径的影响 未接种病原菌时海藻渣与混合菌剂处理黄瓜根部可引起黄瓜叶片内与乙烯相关的基因ACC、EIN2的表达改变，T1、T2处理均显著上调且T2表达水平高于T1，T3变化不显著。接种病菌后CK的EIN2表达上调，ACC表达下调；T1在3 d时ACC的表达水平最高，T2在3 d时EIN2的表达水平最高。EIN2基因表达水平变化与LOX2基因表达水平变化出现相同趋势，ACC基因表达水平变化与LOX1基因表达水平变化出现相同趋势。JA途径与ET途径往往是同时启动的，本研究的数据也验证了这一点（图7）。

图7 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片乙烯途径相关基因表达的影响Fig.7 Effect of seaweed residue on the relative expression level of ethylene pathway pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.5 相关性分析

添加海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂在黄瓜叶片水杨酸含量、黄瓜叶片茉莉酸含量、黄瓜根系水杨酸含量、黄瓜根系茉莉酸含量、黄瓜叶片SOD活性、黄瓜叶片CAT活性、黄瓜叶片PPO活性、黄瓜叶片PAL活性、黄瓜叶片POD活性、黄瓜叶片SA途径基因相对表达量、黄瓜叶片ET途径基因相对表达量的水平均为正相关，相关系数均大于0.62且显著。除CAT酶活正相关系数较低，LOX1成负相关，其他各项均显著正相关。证明在木霉和芽胞杆菌混合菌剂中添加海藻渣增强了黄瓜苗期寄主防御反应，海藻渣和复合菌剂表现出协同增效作用。

图8 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂的黄瓜幼苗水杨酸、茉莉酸含量及基因表达与抗氧化活性酶变化的相关分析Fig.8 Correlation analysis between SA, JA content, gene expression and antioxidant enzymes in cucumber seedlings treated with seaweed residue

3 讨论

已有研究表明，生物防治菌剂与生化类的生物刺激素复配具有协同增效应作用[25]。但利用海藻渣与生防菌剂复配以提高生防菌剂的防病和促生效果研究并不深入。本研究明确了1%的海藻渣与棘孢木霉和解淀粉芽胞杆菌混合菌剂复配能够提高生防菌剂对黄瓜苗期枯萎病的防治效果。海藻渣的添加，提高了棘孢木霉和解淀粉芽胞杆菌混合菌剂对黄瓜叶片及根部的水杨酸、茉莉酸积累，诱导叶片JA、SA、ET途径基因高水平表达，叶片抗氧化酶系活性提高，协同增效作用明显。叶片和根系抗氧化酶系和水杨酸途径相关基因的激活是协同增效的主要机理。

生防微生物诱导植物抗性氧化酶的报导较多[26,27]。Li等[28]用解淀粉芽胞杆菌处理的番茄植株，其PPO和POD活性显著提高，对青枯病病原菌Ralstoniasolanacearum的防效也明显增强；Zhang等[29]用哈茨木霉处理苦瓜也观察到了类似的效果。抗性氧化酶提高可减少病原菌侵染诱导寄主积累过多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生对寄主细胞的损伤，但恰当含量的ROS则能激活植物的防御反应，然而目前还不清楚抗性氧化酶表达水平与诱导抗性的ROS信号间的关系，两者间可能存在一种平衡关系。

生防菌诱导寄主植物水杨酸和茉莉酸信号途径也有大量的报导[30]。Shukla等[31]综述了海藻提取物作为生物刺激素在农业上的应用，海藻提取物中存在的某些生物活性激发子可以激活病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMPs），从而启动和/或诱导系统抗性反应。柴庆凯等[32]研究表明解淀粉芽胞杆菌LJ02可以诱导黄瓜对灰霉病菌抗性，其叶部与根部PR-1基因过表达，证明了解淀粉芽胞杆菌对SA通路的激活。Sudisha等[33]研究表明，绿木霉在番茄发生枯萎病时其菌丝主要诱导SA途径基因PDF1基因上调表达，而其代谢产物主要诱导JA途径基因PR1a上调表达。然而已有报导均仅是说明单一菌剂对防御反应的诱导效应，不能反映海藻渣等物质在混合制剂中的作用，更无法反映海藻渣、木霉+芽胞杆菌、植物三方互作的复杂关系。在这种复杂互作关系中，可能存在对黄瓜防御反应直接或间接的诱导效应，即海藻渣或生防菌本身诱导作用或通过双方互作或通过改变植物响应的敏感性等途径实现协同诱导。本研究发现黄瓜叶片和根系水杨酸信号的变化与海藻渣+木霉+芽胞杆菌诱导的防御反应呈正相关，而茉莉酸信号途径则呈现复杂的变化，暗示海藻渣成分、木霉和芽胞杆菌可能有共同正调控黄瓜SA通路防御反应基因的机制，而三者对黄瓜茉莉酸途径的调控机制可能并不是完全协调的。值得提出的是木霉很多情况下是诱导植物茉莉酸途径上调表达，从而发生系统诱导抗性（induced systemic resistance, ISR），但海藻渣+木霉+芽胞杆菌的复杂互作可能改变了生防木霉的诱导防御反应的信号通路，调动其诱导寄主植物水杨酸的潜力。另外，海藻渣也可能通过改变木霉和芽胞杆菌之间或两者与黄瓜根系之间的关系，从而形成了复杂的诱导抗性机制。虽然目前的试验无法完全解释这一复杂的机制，但添加海藻渣的两种生防菌复合制剂提高了对黄瓜根系和叶片的防御反应相关酶活和信号物质产生的诱导效应，证明了复合生防菌剂添加海藻渣的协同增效价值。由于本研究是在盆栽和苗期条件下明确了海藻渣+木霉+芽胞杆菌防治黄瓜枯萎病的机理，还需要在田间和成株期条件下进一步观察三方互作的协同防病和系统诱导抗性效应。