兔眼角膜胶原交联后角膜动态响应参数的变化*

袁子维，曾正，李冬果，张海霞，李林△

(1.首都医科大学生物医学工程学院，北京 100069； 2.首都医科大学 临床生物力学应用基础研究北京市重点实验室，北京 100069)

引言

角膜生物力学特性与角膜在眼内压作用下的变形相关。近年来，角膜生物力学相关性参数逐渐成为一个重要的指标来评估和诊断角膜扩张性疾病[1-4]、对青光眼的诊断也有辅助作用[5-6]。角膜屈光手术前后角膜生物力学的检测对于避免并发症、评估手术效果尤为重要[7]。

角膜胶原交联最早由Spoerl于1998年提出[8]，其通过增加角膜纤维间的共价键连接来增强角膜的机械强度，是目前临床上有效阻止角膜扩张的一种方法。离体拉伸实验已证实，交联后角膜的力学性质会发生变化[9]。临床研究显示，交联处置后基于可视化角膜生物力学分析仪(corneal visualisation scheimpflug technology，Corvis ST)获取的角膜动态响应参(dynamic corneal response parameters，DCRs)有不同程度地变化[10-11]。

Corvis ST是一款新型可视化角膜生物力学分析仪，采用高速Scheimpflug相机，每秒采集超过4 000帧图像，利用空气脉冲作用于角膜，动态记录并分析角膜受压形变的全过程，获得的DCRs在某种程度上可以反映角膜生物力学特性。Corvis ST具有良好的精确性和可重复性，可以将Corvis ST角膜动态响应参数视为实际角膜生物力学因素的替代指标[12-13]。

通过离体测试了解角膜生物力学性质无法用于临床实践，基于Corvis ST获得角膜动态响应参数可以评估胶原交联角膜的力学特性，因此，本研究对正常兔眼角膜与胶原交联后不同时间角膜动态响应参数的差异进行分析，探讨角膜胶原交联后生物力学特性的变化，为交联处置术式的个性化和评估交联手术术后效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健康新西兰白兔20只，选择左眼进行实验研究，由首都医科大学动物实验中心提供。所有实验均获得当地伦理委员会的批准，并遵循《实验动物管理条例》及ARVO声明。

1.2 方法

术前对兔子进行眼部检查以排除相关疾病。20只健康新西兰白兔左眼为手术眼，右眼为对照眼。对实验兔耳缘静脉注射4 mL 3%戊巴比妥钠进行全身麻醉后，将兔置于手术台。对实验眼滴1～2 滴盐酸奥布卡因滴眼液，实施表面麻醉。而后用经酒精消毒的金属垫片圈定实验眼角膜中央约8 mm区域，注射器滴加75%医用酒精，使角膜中央被酒精充分浸泡30 s。用无菌棉签吸取剩余酒精，PBS反复冲洗，经棉签擦拭后可见角膜上皮剥脱，重复清洗三至四次。去除上皮后，滴加0.1%核黄素溶液，2 min一次，每次1～2 滴，使角膜充分浸泡和渗透20 min。浸泡完成后，使用UV-X TM 2000 角膜交联系统对术眼进行紫外光照射，波长为365 nm，能量密度为 3 mW/cm2，照射时长为30 min，照射过程中保持角膜的核黄素浸润。实验结束后，送回动物房分笼饲养。术后1周给予实验眼妥布霉素地塞米松滴眼液点眼，每日2次，以防止眼部发生感染。

术后3 d(5眼)、1周(11眼)、2周(7眼)、3周(9眼)、4周(14眼)、8周(6眼)、12周(3眼)进行Corvis ST在体测试。获得角膜动态响应参数，见表1。在本研究中，将可以反映角膜硬度的参数SP-A1、IR、DA Ratio 1、DA Ratio 2、SSI与角膜弹性模量E定义为角膜生物力学参数。

表1 角膜动态响应参数

(表1)续

角膜弹性模量计算方法参考前期研究[14]，不做详细描述。根据式(1)计算角膜弹性模量，式中E为弹性模量；f是作用于角膜顶点的空气脉冲力；δ为角膜前表面在空气脉冲下的位移；R为角膜前表面在水平方向上的曲率半径，ν是泊松比，在本研究中ν取0.49；μ由ν、R、t和空气柱半径rp根据式(2)确定，参数c的计算方法由前期研究中得到。

(1)

(2)

角膜交联部分弹性模量计算方法参考前人研究[15]，对角膜弹性性质的分布进行假设：交联部分的弹性模量沿其深度是恒定的，非交联部分的弹性模量也一样。把交联后角膜分成两层，根据式(3)计算角膜交联部分弹性模量，估计交联效果，式中EmCXL是交联后角膜平均弹性模量，即式(1)中计算的E；ECXL是交联部分平均弹性模量；Emc是交联前角膜平均弹性模量，在本研究中Emc取0.24 MPa；t是角膜厚度，本研究中t取410 μm；h是角膜交联深度，本研究中h取210 μm。

EmCXL×t=ECXL×h+Emc×(t-h)

(3)

采用SPSS22.0软件进行统计学分析。使用Shapiro-Wilk检验各组数据正态性。正态分布数据采用均数±标准差进行统计描述，应用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，并用Sidak法做两两比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。偏态分布数据计算中位数和变异范围进行统计描述，应用Kruskal-Wallis检验进行统计分析，采用Bonferroni校正的Mann-Whitney U方法进行组间两两比较。对bIOP、CCT与反映角膜生物力学特性的参数E、SP-A1、IR等进行Pearson和Spearman相关性分析，以P<0.05为显著相关。

2 结果

本研究共选取20只实验兔，对左眼进行标准胶原交联手术。所有实验兔术前基础信息见表2。

表2 实验兔基本信息

2.1 交联术前与术后不同时间角膜动态响应参数变化结果

交联术前与术后不同时间角膜动态响应参数变化,见图1—图2。交联后3 d、1周各测量参数变化较大，但不稳定，并未表现出统计学差异。CCT在交联后12周较3、4周显著升高；HCR在交联后3 d较术前显著升高，交联后3周较3 d显著下降；HCL在交联后1周较术前显著升高，IR在交联后12周较术前、交联后3周显著下降。其它参数并无统计学差异。

根据角膜交联部分弹性模量计算方法，对交联后4周的交联效果进行估计。交联后4周计算得到角膜整体弹性模量平均值为0.332 MPa，据此计算得到角膜交联部分的弹性模量为0.429 MPa，交联部分的弹性模量比整个交联角膜平均弹性模量高出30%，比交联前高出78.7%。

2.2 角膜生物力学参数与角膜bIOP、CCT的相关关系

对角膜bIOP、CCT与反映角膜生物力学特性的参数E、SP-A1、DA Ratio 1、DA Ratio 2、IR、SSI进行Pearson和Spearman相关性分析，结果见表3。E与CCT呈负相关，与bIOP呈正相关；SP-A1与CCT、bIOP呈正相关；DA Ratio 1与CCT呈负相关，与bIOP呈正相关；DA Ratio 2与CCT呈负相关，与bIOP呈正相关；IR与CCT呈负相关，与bIOP无显著相关性；SSI与CCT无显著相关性，与bIOP呈正相关。

图1 角膜基本形变参数变化图

注：正态分布数据用折线图描述，偏态数据用箱线图描述。横坐标为时间分组；3 d、1周、2周、3周、4周、8 周、12周分别表示交联后3 d、1周、2周、3周、4周、8周、12周。纵坐标为各测量参数值。*：P<0.05；**：P<0.01。

表3 角膜生物力学参数与CCT、bIOP相关关系

3 讨论

准确评估角膜的生物力学特性对于交联处置术式的个性化设计和术后效果评估至关重要。本研究对兔眼进行标准胶原交联手术，应用Corvis ST于术后不同时间进行了在体测试，并计算角膜弹性模量，探讨角膜生物力学参数随时间的变化。由图1、图2可知，角膜交联前后各组角膜动态响应参数标准差不大，组内各样本一致性较好。结果显示，术后1周内角膜动态响应参数变化明显，术后2～3月开始趋于稳定。

在标准的胶原交联手术中，有研究观察到人眼角膜在交联后1、2月后CCT显著下降[16-17]。本研究中观察到交联后3 d和1周时CCT平均值短暂升高，且组内CCT标准差较大，可能是部分兔角膜水肿所致，到交联后4周、2月、3月，角膜水肿逐渐恢复，组内CCT值标准差减小，CCT平均值与术前相比无明显变化，说明交联手术改变角膜厚度主要是手术中去除角膜上皮引起的。

Bak-Nielsen等[18]对8名圆锥角膜患者(9眼)交联前后进行Corvis在体测试，发现DA、HCT、A2T有显著上升。Fuchsluger等[19]对圆锥角膜、交联角膜和健康角膜进行测试，发现交联后A2V、DA显著上升，各组间HCR、CCT也有显著差异。Herber等[20]发现猪眼在交联后IR、DA显著减小，IOP、SP-A1显著升高。以上研究显示，交联后A2V、HCR、HCT有显著上升，DA也有显著差异，但各研究结果不一致，可能是DA存在较大个体变异性所致。本研究中交联后HCR、HCL较术前有显著升高，A2V有上升但无统计学差异，DA无明显变化。

数据显示，反映角膜硬度的参数DA Ratio、IR和SP-A1在交联后均有所变化，SSI变化较小。角膜交联后3 d，DA Ratio 1、DA Ratio 2、IR下降，SP-A1升高，Vinciguerra等[21]也得到类似的结果，SP-A1、SP-HC显著上升，IR、DA Ratio显著下降。DA Ratio 1、DA Ratio 2表示角膜顶点与1 mm、2 mm位置最大形变幅度比值，IR表示反向凹面半径曲线下面积，反映了角膜整体硬度，SP-A1是角膜刚度参数，这些参数的变化提示交联手术是有效的，角膜硬度升高。

角膜是一种生物软组织，其应力-应变关系是非线性的[22]，在体角膜受到眼内压的作用，呈现球形前凸状态。目前，通过在体测试识别角膜生物力学依然非常困难。如果将角膜空气冲压测试过程看做薄球壳受压模型，我们前期建立了一种基于Corvis测试结果计算角膜弹性模量的方法，给出了正常兔眼角膜弹性模量为0.16～0.35 MPa[14]。本研究利用该方法，由交联术后兔Corvis ST测试参数计算得到角膜弹性模量E为0.09～0.75 MPa，与文献结果量纲一致。本研究的结果显示交联术后3周E较术前有增加，与角膜交联后经单轴拉伸实验和原子力显微镜压痕实验得到的弹性模量增大的研究结果一致[23-24]。考虑到角膜胶原交联效果仅在前部角膜，而后部角膜并未发生交联[25]，因此，可以认为交联后角膜前部弹性模量增大而后部保持不变，把角膜视为交联前部与非交联后部的两层，估算角膜交联部分的弹性模量，本研究依此计算了兔角膜交联后4周交联部分的弹性模量，结果显示，交联后4周交联部分的弹性模量比整个交联角膜平均弹性模量高出30%，比交联前高出78.7%，与Wollensak等[23]计算得到兔眼杨氏模量显著增加78.4%～87.4%相一致，说明交联是有效的。

我们对角膜生物力学参数与角膜bIOP、CCT的相关关系进行了研究，分析角膜生物力学性质与角膜厚度、眼压的相互作用，为了解角膜生物力学参数如何反映在体角膜生物力学提供帮助。相关性分析结果显示，计算的弹性模量E与角膜CCT和bIOP均有相关性，反映角膜硬度的参数与CCT和bIOP也有显著相关关系。Laplace定律指出，壁面张力是内压的函数。对眼球而言，眼球壁张力会随着眼压的升高而增加，故角膜和巩膜会在高眼压作用下变硬[26]。此外，统计分析交联前后E均有较大变异幅度，而CCT一致性较好，这些信息提示我们角膜硬度不仅仅取决于角膜厚度，高眼压下的软角膜可能比低眼压下的硬角膜表现出更硬的特征，同时在眼压测量过程，也要考虑到角膜硬度的影响。

本研究也有一定的局限性。由于各组样本数量有所差异，且样本数量少，兔个体差异导致术后实验眼恢复情况不同，对结果造成一定影响。此外，Corvis ST还提供了生物力学指数(corvis biomechanical index，CBI)和水平方向Ambrosio厚度(ambrosio relational thickness horizontal，ARTh)。ARTh表示最薄点角膜厚度与厚度变化率比值，其值越小表明角膜厚度薄或由中心向外周变化幅度大，对于研究急性圆锥角膜有重要意义[27]。CBI目前已成为临床上诊断圆锥角膜的一个指标，有较好的诊断性能[27-28]。本研究选用动物正常角膜，未涉及圆锥角膜，故未重点关注这两个参数。

4 总结

综上所述，Corvis ST测得角膜动态参数可以反映出角膜交联后生物力学变化特征，有助于评估交联手术的效果。未来还需进一步扩大样本来观察分析角膜胶原交联后弹性模量、生物力学参数及形态的变化。