基于指标成分指纹图谱技术结合LC-MS的蜂蜜质量分析

袁琛凯，杨 俊，石 敏，周 楠，杨 昱，蒋林惠,*

1.南通市食品药品监督检验中心 (南通 226000) 2.南通市中医院 (南通 226000)

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经巢脾转化、脱水、储存酿造形成的天然甜味剂[1]。蜂蜜中含有机酸、酶、黄酮等活性物质，使得蜂蜜具有抗菌消炎、调节内分泌紊乱等功效，是一种营养价值较高的保健食品和传统中药[2]。酚酸、黄酮是一种多酚类化合物，其中黄酮是一种常见的抗氧化成分，蜂蜜中的黄酮主要来源于植物花粉、花蜜和蜂胶[3]，有研究表明蜂蜜的抗氧化活性与其黄酮含量高低有关，因此黄酮含量逐渐成为评价蜂蜜质量和区分蜜源的一项重要因素，随着检测技术的提高，将黄酮类化合物做为蜂蜜指标成分进行分析已成为鉴别蜂蜜真伪的重要手段[4]。

蜂蜜产量低、需求量大、价格较高，因此成为一些不法商贩掺假制假的目标，目前掺假蜂蜜占蜂蜜市场的20%～30%，有些地区高达50%左右[5]。而蜂蜜成分复杂、各组分含量差异大使得掺假相对容易，目前掺假蜂蜜的检测主要针对外源性掺假物质单一特征成分的分析[6]，鉴于蜂蜜的活性成分复杂，且现阶段的活性成分并不全部明确，单一组分的质量分析具有一定的局限性，而指纹图谱的整体性和模糊性在蜂蜜质量的判断上更具科学性和全面性。

本研究通过对蜂蜜指标成分的分析，结合色谱指纹图谱及质谱，建立一种高效准确的蜂蜜质量分析方法，实验收集若干批蜂蜜，经过HLB固相萃取柱净化，经HPLC建立黄酮类成分指纹图谱，并采用LC-MS对指纹图谱色谱峰定性，为蜂蜜质量评价提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

蜂蜜样品：麦卢卡蜜(澳洲)、黑蜂蜜(吉林)、百花蜜1(湖南)、洋槐蜜(苏州)、野山蜜(湖南)、百花蜜2(云南)；标准品：芦丁Rutin(1ST1522-250 mg 阿尔塔)、槲皮素Quercetin(RMT12165-100 mg 曼哈格)、杨梅酮Myricetin(CDAA-28248-20 mg 安谱)、山奈酚Kaempferol(CDAA-280530-20 mg安谱)；试剂：甲醇/乙腈(MERCK LiChrosolv,色谱级),甲酸(阿拉丁,色谱级),乙酸铵(罗恩试剂,GR>99%)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪/DAD-WR(安捷伦)；Vanquish F-TSQ ALTIS液质联用仪(赛默飞)；Milli Q超纯水机(默克密理博)；poly-sery HLB固相萃取柱-200 mg/6mL(安谱)。

1.3 方法

1.3.1对照品溶液制备

称取槲皮素标准品，甲醇溶解，配置成浓度为1 000 mg/L的标准储备液。

1.3.2样品处理

称取蜂蜜5 g(精确至0.01 g)至50 mL离心管，加入15 mL 0.01mol/L 盐酸，涡旋振荡1 min，超声提取30 min，7 000 r/min离心5 min，取全部上清液到预处理好的HLB固相萃取柱(5 mL甲醇、10 mL 0.01 mol/L HCL活化)，10 mL水淋洗，真空泵抽干小柱，10 mL甲醇洗脱，洗脱液40 ℃氮吹近干，1 mL初始流动性复溶，过0.22 μm有机滤膜。

1.3.3指纹图谱色谱条件

Thermo Acclaim 120 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；洗脱条件为等度洗脱，A为0.3%甲酸水62%，B为乙腈38%；流速0.7 mL/min；柱温35 ℃；进样体积20 μL；检测波长350 nm。

1.3.4LC-MS质谱条件

电离模式：电喷雾离子源ESI-Negative，多反应监测模式(MSM)；毛细管电压为4.3 kV；离子传输管温度为300 ℃；雾化温度400 ℃；鞘气1.67 L/min，辅助气10.08 L/min；吹扫气为0.8 L/min；碰撞气压力1.5 mTorr；柱温35 ℃。

2 结果与讨论

2.1 蜂蜜HPLC指纹图谱测定

2.1.1样品提取方法的选择

2.1.1.1 溶剂的选择

0.01 mol/L盐酸。黄酮类提取方法主要有水提法、碱提法、有机溶剂提取、超声提取、酶解提取、超临界流体萃取法等[7]，根据文献可知采用水提法的性价比较高[8]，由于黄酮类化合物大部分含有酚羟基，显弱酸性，为避免其在中性水溶液中发生解离，本实验采用0.01 mol/L的盐酸溶液作为样品提取剂[9]，其pH≈3。

2.1.1.2 固相萃取柱的选择

poly-sery HLB,采用亲水-亲脂平衡的HLB吸附剂，适用于含水样品中极性与非极性化合物的提取，pH耐受范围1～14，适合酸性提取液的净化，对黄酮等极性化合物的吸附比传统的C18或硅胶基质更高。槲皮素加标回收考察不同比例甲醇对HLB柱的洗脱效果，结果使用纯甲醇的洗脱效率最高，40 ℃氮气吹干，得到净化富集的分析物。

2.1.2色谱条件的优化

2.1.2.1 流动相的选择

实验比较了0.3%甲酸-甲醇、0.3%磷酸-乙腈、0.3%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸铵-乙腈作为流动相的色谱分离效果。结果显示：使用0.3%甲酸-乙腈作为液相色谱流动相，以62∶38的体积比在0.7 mL/min的流速时分离效果最佳，色谱峰型更好、响应度更高。

2.1.2.2 检测波长的选择

根据文献[10]，指纹图谱色谱峰主要为黄酮类物质，该类物质基本在254 nm、360 nm处有最大吸收，配置100 mg/L的槲皮素标准溶液，DAD检测器在260～370 nm范围内每隔10 nm测定1次，最终测得350 nm为最佳吸收波长。

2.1.3指纹图谱的测定

2.1.3.1 精密度试验

取任一样品溶液，按2.1.2项下色谱条件连续进样6次，记录共有峰相对保留时间和峰面积，考察精密度和重复性，以槲皮素为对照峰，选取峰面积百分含量>1%的12个共有峰计算保留时间和峰面积RSD，并计算相似度。结果显示各共有峰的峰面积和相对保留时间的RSD<3%，相对保留时间RSD<3%，仪器精密度良好，方法稳定可靠，符合指纹图谱要求。

2.1.3.2 指纹图谱采集

对6批次蜂蜜进行分析，对照品与样品溶液各进样20 μL采集指纹图谱，将结果导入色谱指纹图谱相似度评价系统2004版，以槲皮素作为参照峰S，标记了12个共有峰，并生成对照指纹图谱，结果见图1。

图1 蜂蜜对照指纹图谱

2.1.3.3 相似度计算

使用色谱指纹图谱相似度评价系统2004版，以生成的对照谱图为参照，对6种蜂蜜的12个共有峰进行指纹图谱相似度分析，结果如表1。

表1 6种蜂蜜指纹图谱与参照图谱相似度

2.2 黄酮类成分分析

选取响应最高的4个色谱峰1、2、4、7号峰作为分析对象，转移至LC-MS进行定性分析，依据液相DAD光谱及文献检索结果[11-13]，初步判定4种黄酮类化合物分别为芦丁、杨梅酮、槲皮素、山奈酚，制备4种黄酮化合物混合标准溶液(1 000 mg/L)，采用单点校正，按1.3.4项MS条件，标准品和样品溶液各进样5 μL，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，流速0.3 mL/min，梯度洗脱。

根据对照品的质谱信息，鉴定出1号峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 609)为芦丁，2号峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 317)为杨梅酮，4号峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 301)为槲皮素，7号峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 285)为山奈酚。4种黄酮组分SRM二级扫描谱图见图2，各化合物优化质谱参数见表2，最终得到的各蜂蜜的黄酮组分含量见表3。

图2 4种黄酮类化合物SRM 二级扫描谱图

表2 4种目标物质谱参数

表3 各蜂蜜的黄酮组分含量 mg/kg

3 结论

(1)本文建立了蜂蜜指标成分HPLC指纹图谱分析方法，采用HLB净化，HPLC对6批次蜂蜜进行检测，以槲皮素作为参照峰，所测6种蜂蜜含有12个共同峰，通过中药色谱指纹图谱软件比对，其相似度均大于0.90，选取最大的4个共有峰LC-MS定性。结果表明：6种蜂蜜中芦丁、杨梅酮、槲皮素、山奈酚含量差异较大，这主要与蜜源植物以及加工工艺不同有关，所测4种黄酮物质在百花蜜1(湖南)中含量最高，百花蜜2(云南)其次，麦卢卡(澳洲)最低。

(2)本方法前处理操作简单，色谱分离度好，稳定性高，以指纹图谱找出不同产地不同品种蜂蜜的共有峰并结合LC-MS为质量控制手段，既具有指纹图谱分析的全面性又避免了液相色谱响应低，不能准确鉴别复杂黄酮化合物的问题，在对蜂蜜及蜂产品有效及全面分析上具有较大优势。