二甲双胍治疗2型糖尿病患者中诱发阿尔兹海默症的相关研究探析

谢冰　王萍　刘峰

摘要：目的：探讨二甲双胍治疗2型糖尿病患者中诱发阿尔兹海默症的相关研究。方法：选取实验鼠，全部为年龄较大的，对于这些老鼠全部给予高脂高糖的食物和饮水，并且一直持续，通过相关糖尿病指标检测后，这些实验鼠全部称为身体素质不健康的T2D损伤大鼠。T2D损伤大鼠模型继续高脂高糖饮食，并分别使用二甲双胍，以及二甲双胍合并甲基化抑制剂进行添加喂养。RNA-seq筛选可能相关作用通路，一直保持给予固定数量的荧光PCR和Western blot ，这样可以在阿尔兹海默症相关基因活动时进行监控，主要监控其DNA转录到RNA，当然还有DNA表达成蛋白质这两个过程，并对两组小鼠进行脑组织病理检测，并对二代基因测序。推测二甲双胍是否通过R-loops影响相关基因甲基化程度，进而影响DNA的稳定性，纵向影响糖尿病并发阿尔兹海默症的进展。结果：小鼠海马神经元细胞HT-22如果进行甲基化抑制剂联合培养，就可以发现细胞中的R-loops水平明显降低，因此使得基因甲基化水平的也明显下降，确定R-loops在神经元细胞内，可以调节基因甲基化水平。而实验组的T2D损伤大鼠模型只是对其进行二甲双胍干预后，检测发现实验组的R-loops水平明显降低，基因甲基化水平的也明显下降。结论：二甲双胍可以通过调节患者R-loops水平，影响DNA的稳定性，改善糖尿病并发阿尔兹海默症。

关键词：二甲双胍;2型糖尿病;诱发阿尔兹海默症：

一、资料与方法

（一）一般资料

R-Loops是由RNA-DNA杂交和DNA移位鏈组成的三链结构，研究表明，其与DNA的稳定性有关，引起相关神经退行性病变。二甲双胍是公认的治疗糖尿病的一种药物，而且医生也是对于2型糖尿病一直给予二甲双胍的治疗，而二甲双胍对于阿尔兹海默症的作用却出现截然不同的两种研究推论。因此，本项目旨在讨论R-Loops与糖尿病并发阿尔兹海默症之间的关系，二甲双胍在糖尿病并发阿尔兹海默中的作用，探索其可能的分子机制，究竟二甲双胍是不是阿尔兹海默症的罪魁祸首，糖尿病并发这个病症是为什么，以下内容将对此进行新的理论论述，并探索分子检测手段等预警机制，为糖尿病治疗提供用药指导。

（二）方法

1）2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2D）损伤大鼠模型的建立：选取实验鼠，全部为年龄较大的，对于这些老鼠全部给予高脂高糖的食物和饮水，并且一直持续，通过相关糖尿病指标检测后，这些实验鼠全部称为身体素质不健康的T2D损伤大鼠。

2）二甲双胍对2型糖尿病损伤大鼠并发阿尔兹海默症中的作用：T2D损伤大鼠模型继续高脂高糖饮食，并分别使用二甲双胍，以及二甲双胍合并甲基化抑制剂进行添加喂养。采用正常饮食的老年大鼠为正常组，定期进行糖尿病相关指标检测，血糖以及相关基因蛋白检测，确认药物对于造模效果的影响;采用Morris水迷宫试验，对各实验组进行记忆相关的脑区功能评价。

3）RNA-seq筛选可能相关作用通路：提取各糖尿病模型组和对照鼠组的脑组织总RNA，交于基因测序公司进行RNA全转录组测序检测。检测结果通过标准化处理、差异筛选后，进行GO分析、Pathway 分析，筛选出二甲双胍影响DNA稳定性-脑轴-神经内分泌功能相关性最大的作用通路。

4）运用qPCR和Western blot方法验证 RNA-seq 筛选出的信号通路各糖尿病模型组和对照鼠组的脑组织总RNA和总蛋白一直保持给予固定数量的荧光PCR和Western blot ，探究RNA-seq ，对于其中的通路中重要蛋白进行筛选，阿尔兹海默症相关基因的转录和表达进行检测。

a）        qPCR：使用Trizol提取组织或细胞的总RNA后，经NanoDrop2000测定浓度;使用TaKaRa PrimerScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒对提取的总RNA进行反转录反应;根据Genebank序列设计目的基因的引物序列并合成;使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂盒在Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR仪上荧光扩增，分析基因转录水平的表达情况。

b）        Western blot：裂解细胞或组织提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度;SDS-PAGE凝胶电泳：条件为恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）;转膜：条件为恒流250mA ，2h;转膜后TBS漂洗，加5%脱脂奶粉室温封闭1小时;一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜;PBST洗膜3次，10min/次;二抗室温孵育1h，PBST洗膜3次后，ECL发光液显影，Quantity one扫描分析。

5）脑组织病理检测：提取各糖尿病模型组和对照鼠组的脑组织，固定包埋后，将其制作成载玻片，对于切片观察，其中的海马形态开始发生改变，观察海马CA1区之中变化最明显，已经形成了老年斑。

6）ChIP和二代基因组测序：提取各糖尿病模型组和对照鼠组的脑组织，肌肉组织，外周血单核细胞，加入裂解液后进行超声处理，然后加入S9.6抗体，染色质共沉淀（ChIP）， 捕获RNA/DNA杂合体，然后超声打断或酶切，送测序公司对DNA纯化物进行二代测序。分析各样本中R-loops的形式，富集区域，GO分析所富集区域涉及的相关通路，比较正常样本与糖尿病样本，糖尿病并发阿尔兹海默症样本，以及二甲双胍干预后样本间R-loops的差异性。

7）DNA 甲基化测序：提取各糖尿病模型组和对照鼠组的肌肉组织细胞以及外周血单核细胞的基因组DNA，分析各样本中甲基化富集区域，甲基化形式和富集量，GO分析所富集区域涉及的相关通路，比较正常样本与糖尿病样本，糖尿病并发阿尔兹海默症样本，以及二甲双胍干预后样本间甲基化的差异性，推测二甲双胍是否通过R-loops影响相关基因甲基化程度，进而影响DNA的稳定性，纵向影响糖尿病并发阿尔兹海默症的进展。

（三）觀察指标

1）     小鼠海马神经元细胞HT-22进行单独培养，甲基化抑制剂联合培养，对比其R-loops水平，基因甲基化水平的差异，确定R-loops在神经元细胞内，可以调节基因甲基化水平。对小鼠海马神经元细胞HT-22进行二甲双胍干预后，检测其R-loops水平，基因甲基化水平的改变。

2）     通过Qpcr/Western blot验证相关差异基因，凋亡通路蛋白表达，以及Tau蛋白等磷酸化蛋白修饰情况变化，从而探索二甲双胍是否可以调节患者R-loops水平。对Tau蛋白等磷酸化蛋白修饰情况的检测，确定其变化，验证二甲双胍是否可以通过调节患者R-loops水平，影响DNA的稳定性，改善糖尿病并发阿尔兹海默症。

二、结果

小鼠海马神经元细胞HT-22如果进行甲基化抑制剂联合培养，就可以发现细胞中的R-loops水平明显降低，因此使得基因甲基化水平的也明显下降，确定R-loops在神经元细胞内，可以调节基因甲基化水平。而实验组的T2D损伤大鼠模型只是对其进行二甲双胍干预后，检测发现实验组的R-loops水平明显降低，基因甲基化水平的也明显下降。

三、讨论

糖尿病作为最常见的多病因代谢性疾病，发病率高，并发症多，易引起多器官损伤，且该病发病机制异常复杂，目前仍未能完全阐明。阿尔茨海默氏病是一种神经退行性疾病，65岁以上的人中约十五分之一的人群有患病风险。前期研究表明，60岁以上患有2型糖尿病的人患阿尔茨海默氏症的可能性是没有糖尿病的两倍。糖尿病对供给细胞和神经小细管的损害，可能是阿尔兹海默症在糖尿病患者中更普遍的原因之一。R-Loops是由RNA-DNA杂交和DNA移位链组成的三链结构，研究表明，其与DNA的稳定性有关，引起相关神经退行性病变。二甲双胍是公认的治疗糖尿病的一种药物，而且医生也是对于2型糖尿病一直给予二甲双胍的治疗，而二甲双胍对于阿尔兹海默症的作用却出现截然不同的两种研究推论。因此，本项目旨在讨论R-Loops与糖尿病并发阿尔兹海默症之间的关系，二甲双胍在糖尿病并发阿尔兹海默中的作用，探探索其可能的分子机制，究竟二甲双胍是不是阿尔兹海默症的罪魁祸首，糖尿病并发这个病症是为什么，以下内容将对此进行新的理论论述，并探索分子检测手段等预警机制，为糖尿病治疗提供用药指导。

本课题负责人在前期的工作中通过临床病例研究和动物实验研究，初步观察到肠道菌群可能通过影响肠/脑轴-神经内分泌功能在糖尿病的发生发展中起作用。随后，通过高通量测序技术对比检测了有无接受糖尿病患者肠道菌群移植的无菌小鼠的肠上皮和脑组织以及糖尿病患者和健康人来源的ips细胞诱导分化的胰岛β细胞基因转录水平的变化，初步筛选出宿主生物钟信号通路的改变可能是肠道菌群影响肠/脑轴-神经内分泌功能引起糖尿病的分子机制。以上临床及基础研究工作都为本项目的开展提供了坚实的预实验基础。

参考文献：

[1] MANO T， NAGATA K， NONAKA T， et al. Neuron-specific methylome analysis reveals epigenetic regulation and tau-related dysfunction of BRCA1 in Alzheimer's disease [J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2017， 114（45）： E9645-E54.

[2] JACKSON K C， GIDLUND E K， NORRBOM J， et al. BRCA1 is a novel regulator of metabolic function in skeletal muscle [J]. Journal of Lipid Research， 2014， 55（4）：668-80.