基于HPLC指纹图谱、化学计量学和网络药理学技术探讨锁阳的质量标志物

吕 鑫，顾志荣，张 锐，葛 斌

（1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000）

锁阳是锁阳科植物锁阳（Cynomorium songaricum Rupr.）的干燥肉质茎，分布地区以内蒙古、甘肃河西走廊、青海、新疆等的沙漠和半沙漠区域为主。锁阳味甘，性温，以强壮作用而著名，主治阳痿滑精、腰膝痿软、肠燥便秘等［1］。现代研究证实，锁阳含有黄酮类（如表儿茶素、儿茶素、异槲皮苷、柑桔素、柚皮苷、根皮苷、柚皮素、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷等）、多糖类、三萜类（如熊果酸、乙酰熊果酸、熊果酸丙二酸半酯、齐墩果酸丙二酸半酯、3β-丙二酸单酯、三萜皂苷等）、有机酸（如没食子酸、原儿茶酸、十八碳烯酸、琥珀酸、棕榈酸等）、鞣质等多种化学成分［2］，具有提髙免疫力、抗氧化、改善性机能、益智、抗应激、抗糖尿病、抗血小板聚集及神经保护等多种药理作用［3］。2020 年版《中国药典》中，锁阳仅有醇溶性浸出物一项质控成分，没有其他有效成分、指标成分或有效部位的含量测定，因此其内在质量评价与质量控制是目前存在的难题之一。

中药材质量是影响中医药现代化进程的重要因素，但由于成分复杂，有效成分易受产地环境因素影响，加之各地栽培、采收、加工等方式不同，导致中药材质量良莠不齐，从而影响临床疗效。因此，如何科学、准确、有效地评价中药材质量，已成为完善中药质量控制体系的关键前提［4］。而中药质量标志物（Quality marker，Q-marker）的提出，一方面反映了中药的安全性和有效性，另一方面对于建立、健全中药全程质量控制及质量溯源体系具有指导作用［5］。中药指纹图谱可较为全面反映中药中复杂成分及含量分布信息，具有整体性、系统性和模糊性等特点，可对中药质量进行整体描述和综合评价［6-7］。网络药理学打破了以往中医药分子机制不明确的瓶颈，与中医的核心思想“整体观念、辨证论治”相契合，能对多成分、多靶点、多通路进行整合，适用于药物潜在生物活性的研究［8］。本文通过建立锁 阳 的（High performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱，建立正交偏最小二乘（Orthogonal partral least squares，OPLS）模型探讨HPLC 指纹图谱上的质量差异性成分；再采用网络药理学技术筛选其广泛的靶点和网络通路，优化所得质量差异性成分，两者相互佐证，预测锁阳潜在的Q-marker，为锁阳的质量控制、药效评价及作用机制研究提供参考。

1 仪器与材料

岛津LC-16 型高效液相色谱仪（岛津仪器有限公司），AL204型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

20 批锁阳样品，采集（购）于甘肃、内蒙古、新疆、青海、宁夏等5 个省（自治区），经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为C.songaricum Rupr. 的干燥肉质茎。将样品晾干，粉碎，过80 目筛。对照品没食子酸（批号：CHB171107，含量≥98%）、原儿茶酸（批号：CHB170822，含量≥98%）、儿茶素（批号：CHB170313，含量≥98%），均购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲醇、甲酸为色谱纯（天津市大茂化学试剂厂），其他试剂均为分析纯（天津大茂化学试剂厂），水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WondaSil C18-WR 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（9∶91），体积流量：0.8 mL/min，等度洗脱，柱温：30℃，检测波长：258 nm，进样体积：10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、儿茶素、原儿茶酸的对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.11、0.01、0.40 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液制备

取锁阳粉末约2.0 g，加入纯化水10 mL，称定质量，超声提取60 min（功率500 W，频率40 kHz，温度20℃），放冷，再次称重，用纯化水补足减失的质量，以4000 r/min 离心10 min，取上清液，过滤，取续滤液，即得。

2.4 HPLC指纹图谱建立

2.4.1 精密度试验

取供试液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6针，记录色谱图。以12 号峰为参比峰，得到16 个共有峰相对保留时间的RSD 在0.2% ～2.0%之间，相对峰面积的RSD 在0.1% ～2.4%之间，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一供试品6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以12 号峰为参比峰，得16 个共有峰相对保留时间的RSD 在0.1% ～2.0%之间，相对峰面积的RSD在0.1%～2.8%之间，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取样品供试液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样，记录色谱图。以12号峰为参比峰，得16 个共有峰相对保留时间的RSD在0 ～2.0%之间，相对峰面积的RSD 在0 ～2.8%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 指纹图谱建立

从LabSolutions 化学工作站中导出二维色谱原始数据，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版）对指纹图谱进行分析，分别进行多点校正和色谱峰匹配，生成HPLC 指纹图谱，采用平均数法生成对照图谱（R）。见图1。

图1 20批锁阳指纹图谱及对照图谱（R）Fig. 1 Fingerprint and control chromatogram（R）of 20 batches of C. songaricum

2.4.5 相似度评价

以R 作为参照图谱，采用“夹角余弦法”计算相似度（S），见表1。20 批锁阳的相似度均在0.908 ～0.997 之间，表明20 批锁阳药材具有较好的质量均一性。

表1 锁阳指纹图谱相似度Table 1 Similarity of fingerprint of C. songaricum

2.4.6 共有峰指认

对照图谱（R）中共指认出了16 个共有峰，通过比对紫外吸收图及混合对照品色谱图，确定了没食子酸（1 号峰，t= 4.193 min）、原儿茶酸（6 号峰，t=7.744 min）、儿茶素（14 号峰，t= 17.063 min）共3 个成分。共有模式上12号峰与相邻峰的分离度好、峰面积大、且较稳定，故作为参比峰，以此得16个共有峰相对保留时间的RSD在0.1%～2.2%之间。

图2 混合对照品溶液（C）和锁阳HPLC指纹图谱的共有模式（R）色谱图Fig. 2 HPLC chromatograms of the mixed solution of reference substances（C）and common patterns of fingerprints（R）

2.5 OPLS分析

对20 批锁阳HPLC 指纹图谱上16 个共有峰的峰面积进行“归一化”处理，以归一化数据为变量，采用SIMCA-P 14.1 软件进行OPLS 分析及载荷分析。OPLS 载荷图见图3、VIP 分析见图4。OPLS 模型的主成分回归系数Q2Y= 0.7204＞0.5，R2Y=0.802 2，表明所建模型的拟合度较好，能够解释指纹图谱数据80.22%的信息。载荷分析是分析变量对整体数据贡献（重要性）的分析方法，载荷图中距离原点越远，表示该变量的权重越大，对于整体数据的贡献越大，即该色谱峰所代表的化学成分在决定样品质量差异中的作用越大。由图3-4 可知，峰1、6、11、14、16 距离原点较远，变量重要性投影值（VIP）＞1，对于整体数据的贡献较大，因此是锁阳的质量差异性成分，是锁阳综合质量控制与评价的备选成分。

图3 16个共有峰的载荷图Fig. 3 Loading plots of 16 common peaks

2.6 网络药理学研究

2.6.1 候选化合物靶点预测

检索TCMSP、PubChem Compound、TTD、Swiss Target Prediction、NCBI、CTD、BATMAN-TCM、Sym-Map 数据库中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素3 个候选化合物的作用靶点，在Uniprot数据库中将得到的靶点蛋白信息进行标准化，将筛选出的靶点蛋白合并、去重，最终得到与3 个化合物相关的322 个靶点蛋白。

2.6.2 PPI网络构建

将筛选出的322 个靶点导入STRING 11.0 在线数据库平台进行PPI网络分析，选择物种为人类，设置高可信度＞0.99，将网络中无联系的节点隐去，剩余参数保持不变，获得核心靶点蛋白互作网络图（图5），结果共获得133 个节点，192 条边。将STRING 数据库得到的结果以TSV 文本格式导入Cytoscape 3.7.2软件，利用工具栏中“Network Analyzer”功能对PPI 网络进行拓扑属性分析，以“度值”（Degree）为主要条件，“介数中心性”（Betweenness centrality）和“接近中心性”（Closeness centrality）为次要条件，筛选得到13个核心靶点，结果见表3。经分析发现，这13个靶点与没食子酸、原儿茶酸、儿茶素3个成分有关。

表2 候选化合物基本信息Table 2 Basic information about candidate compounds

表3 靶点网络的拓扑学性质Table 3 Topological properties of target networks

2.6.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用R 语言软件ClusterProfiler 信息包进行GO富集分析，选取标准为P＜0.05。结果表明，锁阳的分子功能调控包括泛素蛋白连接酶结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合、DNA 结合转录激活因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性等54 个生物过程；同法进行KEGG 通路富集分析，选取标准为P＜0.05，得到117个信号通路。与本研究关系较大的结果包括乙型肝炎通路、EB 病毒感染通路、人类T 细胞白血病病毒1 感染通路、麻疹通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、病毒致癌作用通路、细胞凋亡通路等，以上筛选得到的通路主要涉抗炎、抗病毒、抗肿瘤等。进一步对前20 条结果做可视化处理（图5），结果显示锁阳可通过调节多个生物过程及通路的协调参与增强免疫、清除自由基、抗氧化、抗疲劳等过程。

图5 核心靶点PPI网络Fig. 5 PPI network diagram of core targets

表4 基因生物学过程及通路富集分析Table 4 Gene biological process and pathway enrichment analysis

2.6.4 “成分-靶点-通路”网络构建

以13 个核心靶点相关的3 个成分、11 条通路为节点，在Excel 中建立彼此的对应关系及各自属性，将表格分别导入到Cytoscape 3.7.2 软件中进行可视化展示，构建“成分-靶点-通路”关系网络（图6），其中所选形状面积越大代表通路或基因在网络中作用越显著。结果表明，锁阳是通过多靶点、多途径发挥协同作用的。在Cytoscape 3.7.2 软件中“Tools”模块下选择“Network Analysis”功能对整个网络进行分析，将所得文件导出至Excel，以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度（degree）为参考，结果表明化合物没食子酸（degree=11）有较高的连接度，且远高于其他2 个化合物，表明没食子酸可能是锁阳的重要活性成分。RELA（degree = 13）、TP53（degree =11）、AKT1（degree = 11）、CASP8（degree = 10）、CDKN1A（degree ＝10）的连接度大于等于10，高于其他靶点，表明这5 个靶点发挥的作用可能更关键。乙型肝炎通路（degree = 12）、EB 病毒感染通路（degree = 11）、人类T 细胞白血病病毒1 感染通路（degree= 11）、麻疹通路（degree= 9）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路（degree=9）、病毒致癌作用通路（degree=9）、人类乳头瘤病毒感染通路（degree=9）的连接度高于其他通路，表明这7 条通路可能是锁阳潜在Q-marker的重要信号通路。

图6 关键靶点的KEGG通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of key targets in KEGG pathway

图7 “成分-靶点-通路”网络Fig. 7 Network diagram of Component-Target-Pathway

3 讨论

Q-marker 的概念是由刘昌孝院士在2016 年提出的，主要以中药安全性及有效性的标示性物质进行中药质量控制［9］。本研究首先建立锁阳药材的HPLC 指纹图谱，然后建立OPLS 模型筛选质量差异性成分，再联合网络药理学技术进一步确定锁阳的Q-marker，最终发现没食子酸是备选的锁阳质量控制与评价的特异性成分。据报道，没食子酸具有抗菌［10］、神经保护［11］、抗氧化、基因保护及肝脏保护等作用［12］，能够同时提高α-和降低β-分泌酶活性、抑制神经炎症和稳定大脑氧化应激、逆转阿尔茨海默病小鼠的认知损害并减轻病理改变［13］。亦有研究表明，没食子酸是一种新的免疫蛋白酶体抑制剂，可能成为治疗高血压和血管功能障碍的潜在药物［14］。

与没食子酸相关的5个关键靶点，RELA是一种广泛存在的转录因子，被特定的抑制剂以非活性状态保存在细胞质中，当抑制剂降解时，RELA 移向细胞核并激活特定基因的转录；TP53是一个最重要的抑癌基因，该基因的异常与超过半数的肿瘤相关［15］。此外，TP53 也能起到转录因子之外的作用，与胞质中的Bcl2 家族蛋白发生相互作用，使得线粒体外膜通透性增高，诱发细胞凋亡；AKT1 基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依赖的机制被胞外信号激活，发挥调节细胞的功能，异常活化的AKT 会导致肿瘤发生［16］。CASP8 编码半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族的一个成员，连续激活在细胞凋亡的执行阶段起着中心作用，主要参与凋亡抑制通路；CDKN1A编码一种有效的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，在DNA合成预备期或复制前期（G1 期）起调节细胞周期进展的作用。因此，与没食子酸相关的关键靶点主要参与细胞增殖、免疫相关、炎症相关、血管生成、凋亡抑制、能量代谢等信号通路。

锁阳是中、蒙医等常用的药材，也是功能保健食品的常用原料，具有较好的开发应用前景，但目前市场上的锁阳药材质量参差不齐。2020 年版《中国药典》中，锁阳仅有醇溶性浸出物一项质控成分，没有其他有效成分、指标成分或有效部位的含量测定标准。因此，建立科学、高效、灵敏的锁阳质量控制方法，对于保证锁阳药材质量，规范其交易流通，助力锁阳相关产业的健康发展均有实际意义。本研究表明，没食子酸可作为锁阳潜在的Q-marker，这一结果为锁阳的质量控制、功效关联物质研究及作用机制研究提供了一定参考。但目前关于采用指纹图谱与网络药理学技术联用预测中药质量控制指标的研究仍存在着一定的不足，就指纹图谱建立而言，由于药材中某些化学成分含量较低以及色谱分离困难或前处理方法专属性不强，导致最终建立的指纹图谱只能反映部分成分；而网络药理学本身依赖于数据库挖掘，所以候选化合物靶点数量的多少将影响质量标志物的选取结果。因此，完善中药质量控制体系及推进中医药现代化还需进行大量的研究工作。